Ces dernières années, le phénotype mécanique des cellules (comme l'adhésion, l'élasticité, la rigidité), également connu sous le nom de propriétés mécaniques, s'est avéré être un identificateur valide pour distinguer les cellules saines des cellules malades. Des chercheurs du monde entier ont établi un lien entre le phénotype mécanique et le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies liées au sang, entre autres. La microscopie à force atomique (AFM) est la technique la plus utilisée pour mesurer les propriétés mécaniques et permet d'obtenir les propriétés à l'échelle nanométrique. Cependant, la manipulation de l'AFM nécessite des compétences techniques élevées, et au départ, elle n'a pas été conçue pour les échantillons biologiques. Cependant, la capacité d'analyser des échantillons dans l'air ou dans les liquides au cours des dernières années la rend plus attrayante pour l'espace de vie. Mais, dans son état actuel, il n'est pas possible d'analyser un grand nombre de cellules. Cette thèse de doctorat vise à résoudre le problème du faible débit, et une méthodologie automatisée est proposée pour le faire. Cette méthodologie est basée sur la combinaison de deux techniques, les réseaux de cellules et l'automatisation AFM. Les mesures mécaniques se font automatiquement en exécutant un script développé dans ce travail de thèse, et les cellules sont immobilisées dans des positions connues grâce aux réseaux de cellules.
La méthodologie commence par l'immobilisation des cellules. L'immobilisation se fait pour les microbes dans les timbres PDMS microfabriqués et les cellules de mammifères dans les réseaux cellulaires commerciaux (BIOSOFT et CYTOO). L'immobilisation se fait, dans le cas des microbes, à l'aide d'une technique d'assemblage convectif/capillaire atteignant un taux de remplissage de ~85 %. Et pour les cellules de mammifères, elles étaient attachées à une surface préalablement fonctionnalisée. Ensuite, l'AFM a été modifié pour effectuer les mesures automatiquement. L'automatisation a été réalisée en développant un script écrit en Jython et exécuté directement dans un BioAFM commercial. Le script effectue un petit nombre d'empreintes (9 ou 16) sur l'échantillon, en acquérant des courbes de force provenant de différentes régions des cellules et en réduisant en même temps le temps passé sur chaque cellule.
Les résultats démontrent que l'augmentation du nombre de cellules a un impact sur le nombre de mesures effectuées sur les cellules, et il est toujours possible d'obtenir des résultats comparables aux résultats rapportés dans la littérature. Pour la première fois, l'analyse de rigidité sur ~900 cellules de levure (C. albicans) en 4 h est rapportée et l'on observe la présence de sous-populations. Nous avons comparé des cellules indigènes à des cellules de C. albicans traitées à la caspofongine. Pour les cellules HeLa, la comparaison a été faite entre les cellules HeLa natives et les cellules HeLa fixes, et environ 80 cellules ont été analysées en 30 minutes. Dans les deux cas (cellules de mammifères et de levures), on a observé un décalage entre les cellules indigènes et les cellules traitées, ce décalage correspond à la littérature et prouve qu'il est possible de réduire le nombre d'indentations faites sur les cellules. Grâce à l'énorme quantité de données recueillies, il a été possible d'utiliser l'apprentissage automatique, et les résultats préliminaires montrent qu'il est possible de distinguer les cellules indigènes des cellules traitées. La différenciation s'est faite en entrant les descripteurs : rigidité, adhérence, et travail d'adhésion à l'algorithme d'apprentissage machine.
Ce travail contribue à l'obtention d'une signification statistique, qui est l'un des principaux inconvénients de l'analyse mécanique AFM et peut être considéré comme l'une des premières étapes pour réaliser un outil de diagnostic au microscope à force atomique. |
In recent years mechanical phenotype of cells (such as adhesion, elasticity, stiffness), also known as mechanical properties, has been proved to be a valid identifier to distinguish healthy cells from diseased cells. Researchers around the world have related the mechanical phenotype to cancer, cardiovascular, and blood-related diseases, among others. Atomic force microscopy (AFM) is the most used technique to measure mechanical properties, and it makes it possible to obtain the properties at the nanoscale. However, AFM manipulation requires high technical skills, and initially, it was not designed for biological samples. However, the capability to analyze samples in air or liquid in recent years makes it more appealing for the living area. But, in its current state, it is not possible to analyze a high number of cells. This difficult the validation of results because it is not easy to obtain statistical significance. This doctoral thesis aims to solve the problem of low throughput, and an automated methodology is proposed to do it. This methodology is based on the combination of two techniques, cell arrays, and AFM automation. The mechanical measurements are done automatically by executing a script developed in this thesis work, and the cells are immobilized in known positions thanks to the cell arrays. Also, the methodology proposes a change in the number of measurements taken.
The methodology starts with the immobilization of the cells. Immobilization is done for the microbes in microfabricated PDMS stamps and the mammalian cells in commercial cell arrays (BIOSOFT and CYTOO). The immobilization is done, in the case of the microbes, using convective/capillary assembly technique reaching ~85 % filling rate. And for the mammalian cells, the techniques used are attaching the cell to a surface previously functionalized. Next, the AFM was modified to perform the measurements automatically. The automation was made by developing a Jython written script and executed directly in a commercial BioAFM. The script is versatile, and it has been adapted, or it can be adapted to several sample configurations. The script performs a small number of indentations (9 or 16) on the sample, acquiring force curves from different regions of the cells and at the same time, reducing the time spent on each cell.
The results demonstrate that increasing the number of cells impacts the number of measurements done to the cells, and it is still possible to obtain results comparable to the results reported in the literature. For the first time, the stiffness analysis on ~900 yeast cells (C. albicans) is reported, and it's evident the presence of subpopulations. We compared native yeast cells against caspofungin treated yeast cells. The results were obtained in 4 h with 9 indentations per cell. For the HeLa cells, the comparison was made between native HeLa cells and fixed HeLa cells; and ~80 cells were analyzed in 30 minutes. In both cases (mammalian and yeast cells), a shift between the native and treated cells was observed, this shift agrees with the literature and proves that is possible to reduce the number of indentations done to the cells if the number of analyzed cells is high. Thanks to the massive amount of data collected, it was possible to use Machine learning, and the preliminary results show that it is possible to distinguish between native and treated cells. The differentiation was made entering the descriptors: stiffness, adhesion, and work of adhesion to the machine learning algorithm.
This work contributes to achieving a statistical significance, which is one of the main drawbacks of AFM mechanical analysis and can be considered as one of the first steps to achieve a diagnostic tool from the atomic force microscope. |