Détection précoce de la prise de xénogreffe de leucémie aiguë myéloïde (LAM) chez la souris à l’aide d’un prélèvement sanguin non terminal
L’efficacité de nouvelles thérapies de la leucémie aiguë myéloïde est testée en observant leurs effets chez des souris immunodéficientes (NOD/LtSz-scid IL2Rγchainnull ou NSG) greffées avec des lignées de cellules de LAM humaines. Pour s’assurer de la prise de la greffe on a actuellement recours à des myélogrammes, un examen biologique très invasif devant être lu par des spécialistes. Le but était donc de substituer un ou plusieurs marqueurs sanguins, moins invasifs, qui soient aussi, voire plus, précoces que le myélogramme.
Une première série de travaux a permis de démontrer que les conditions pré-analytiques permettant d’obtenir un spécimen sanguin de très bonne qualité pour des analyses hématologiques et biochimiques, en respectant la survie de la souris et son bien être étaient les suivantes : anesthésie à l’isoflurane, ponction de la veine jugulaire à l’aiguille 25G, aspiration douce de 100 à 200 µL dans un tube EDTA. Dans ces conditions, on n’observe que peu d’agrégats plaquettaires et l’addition d’agents anti-agrégants est sans effet. Le facteur déterminant de la qualité du spécimen est alors celle de la qualité de l’acte de prélèvement.
L’utilisation de marqueurs sanguins nécessite d’en connaître les intervalles de référence. Cela a été fait conformément aux recommandations internationales pour les bilans hématologiques et biochimiques de routine des souris NSG dans des effectifs réduits (20 mâles et 20 femelles) pour des raisons éthiques ainsi que de coût des animaux. Par comparaison à des souris habituellement utilisées la principale différence est la faible concentration de leucocytes, principalement de lymphocytes. Il en résulte également que l’identification des types de leucocytes par les analyseurs est souvent erronée et doit être faite sur un frottis sanguin par comptage au microscope.
L’ensemble des analyses pouvant prendre beaucoup de temps, il est nécessaire de s’assurer de la stabilité des analytes étudiés dans le sang de souris. Après avoir étudié les variations des bilans hématologiques pendant 72 heures à température ambiante et en réfrigération, il apparaît que, comme dans les autres espèces, plus l’analyse est précoce meilleure est la stabilité et qu’au-delà de 24 h à 4°C des altérations notables apparaissent qui doivent être connues pour l’interprétation ; un autre point essentiel est que le frottis sanguin doit être fait le plus précocement possible pour limiter au maximum les anomalies morphologiques.
Chez des souris NSG ayant subi une greffe de cellules de LAM humaine, peu de variations sont observées après 10 jours alors qu’elles sont nombreuses à J17, notamment avec une augmentation des concentrations de neutrophiles et de monocytes. Ces anomalies ne sont pas plus précoces que la chronologie connue des greffes mais elles sont accompagnées d’images spécifiques des nuages de points générées en cytométrie de flux, identifiables par des non-spécialistes à la différence de l’analyse des myélogrammes donnant ainsi un marqueur très peu coûteux accessible à tous les laboratoires sans compétence spéciale en cytologie.
Ayant ainsi défini les conditions pré-analytiques d’obtention de spécimens sanguins de qualité chez la souris et montré que la prise de greffe de lignées cellulaires de LAM est facilement identifiable avec une simple analyse hématologique de routine, il devient possible d’envisager leur utilisation en augmentant le nombre d’analyses chez le même sujet en réduisant le volume collecté à 50 µL ce qui pourrait permettre une détection plus précoce de la prise de greffe ; de même on peut étudier si des variations analogues sont observées lors de greffes de LAM provenant de patients (PDX). |
The efficacy of new therapies for acute myeloid leukaemia is tested by observing their effects in immunodeficient mice (NOD/LtSz-scid IL2Rγchainnull or NSG) grafted with human AML cell lines. Currently, myelograms, a highly invasive biological test that has to be read by specialists, are used to ensure the success of the graft. The aim was therefore to substitute one or more blood markers, less invasive and as or more precocious than the myelogram.
A first series of studies demonstrated that the pre-analytical conditions allowing to obtain a blood specimen of very good quality for haematological and biochemical analyses, while respecting the survival of the mouse and its well-being, were the following: anaesthesia with isoflurane, puncture of the jugular vein with a 25G needle, gentle aspiration of 100 to 200 µL into an EDTA tube. Under these conditions, few platelet aggregates are observed and the addition of anti-aggregating agents has no effect. The determining factor for the quality of the specimen is therefore the quality of the sampling procedure.
The use of blood markers requires knowledge of their reference ranges. This was done in accordance with international recommendations for routine haematological and biochemical testing of NSG mice in small numbers (20 males and 20 females) for ethical reasons as well as animal costs. Compared to commonly used mice the main difference is the low concentration of leukocytes, mainly lymphocytes. This also means that the identification of leukocyte types by analysers is often wrong and has to be done on a blood smear by microscopic counting.
As all the analyses can be time-consuming, it is necessary to ensure the stability of the analytes studied in mouse blood. After studying the variations in haematological balances for 72 hours at room temperature and under refrigeration, it appears that, as in other species, the earlier the analysis, the better the stability, and that after 24 hours at 4°C, significant alterations appear which must be known for interpretation. Another essential point is that the blood smear must be perform as early as possible to limit morphological abnormalities to a minimum.
In NSG mice transplanted with human AML cells, few variations are observed after 10 days but many are observed at D17, notably with an increase in neutrophil and monocyte concentrations. These abnormalities are no earlier than the known graft chronology but are accompanied by specific flow cytometrically generated scatter images, identifiable by non-specialists unlike myelogram analysis thus giving a very inexpensive marker accessible to all laboratories without special cytology expertise.
Having thus defined the pre-analytical conditions for obtaining quality blood specimens in mice and shown that engraftment of AML cell lines is easily identifiable with a simple routine haematological analysis, it becomes possible to envisage their use by increasing the number of analyses in the same subject by reducing the volume collected to 50 µL, which could allow earlier detection of engraftment; similarly, it is possible to study whether similar variations are observed in AML transplants from patients (PDX). |