L’utilisation des pesticides en agriculture a permis une énorme avancée en termes de rendements, de contrôle des ravageurs et des vecteurs de maladies. Cependant, des études épidémiologiques suggèrent que l’exposition cutanée aux pesticides, leur ingestion et leur inhalation pourrait affecter la santé humaine à travers une dérégulation des cellules du système immunitaire. Parmi ces cellules, les macrophages jouent un rôle clé dans la défense anti-infectieuse, anti-tumorale et dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. Le dysfonctionnement par des pesticides, de l’une de ces fonctions pourrait avoir des conséquences graves sur le déclenchement et le développement de maladies infectieuses, auto-immunes, neurodégénératives et de cancers.
Le premier objectif de cette thèse a consisté à évaluer l’impact de 7 pesticides de différentes classes chimiques, utilisés en arboriculture fruitière, sur les fonctions effectrices des macrophages dérivés de monocytes humains. Parmi ces pesticides seuls le boscalide n'a eu aucun effet. Le thiaclopride a favorisé la capacité des macrophages à produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de l’IL-10 en réponse à un stimulus inflammatoire. Le chlorpyrifos, le thiophanate et le zirame ont augmenté la production de ROS à faibles doses (0,01-0,1 µM) tandis qu'à fortes doses (10 µM) le chlorpyrifos, le zirame, le captane et le dithianon ont montré des effets immunosuppresseurs en réduisant la production de ROS et les cytokines pro-inflammatoires (IL-1β, TNFα). Ces données suggèrent qu’une exposition au chlorpyrifos, zirame, captane et dithianon, peut compromettre l'élimination des agents pathogènes microbiens par les macrophages.
Le deuxième objectif a été de déterminer le mécanisme par lequel le zirame (diméthyldithiocarbamate de zinc) inhibe les fonctions effectrices des macrophages. Pour évaluer le rôle du zinc dans le mécanisme d’action de ce fongicide, nous avons comparé les effets du zirame à ceux du disulfirame, (dithiocarbamate sans zinc) en co-incubation ou non avec du sulfate de zinc. Nous avons montré que le zirame à 10 µM a complètement inhibé la fonction phagocytaire, l’hyperactivité oxydative et la production de TNFα, IL-1β, IL-6, CCL2 par des macrophages en conditions inflammatoires. Le disulfirame a eu les mêmes effets uniquement combiné avec du sulfate de zinc (10 µM). Le rôle du zinc dans l’effet du zirame a aussi été confirmé par la mise en évidence d’une induction dans les macrophages de l'expression (i) des gènes antioxydants HMOX1, SOD2, CAT, (ii) de gènes marqueurs d’une polarisation des macrophages vers un phénotype anti-inflammatoire M2 qui est souvent associé à diverses maladies liées à la suppression des défenses de l’hôte.
Le troisième objectif a été de déterminer une exposition cutanée aux pesticides. A l’aide de modèles de monoculture et de coculture associant (ou non) des kératinocytes et des hMDM de part et d’autre d’une membrane perméable, nous avons montré que le dithianon à 10 µM, régulait positivement les ARNm de TNFα, IL-1β, IL-6, IL-10, TGFβ après 48h dans la monoculture de kératinocytes et après seulement 24h dans la coculture avec des hMDM. Nous avons également établi que les kératinocytes exposés à 10 µM de dithianon ont déclenché la production de ROS par les hMDM après 48 et 72h de coculture. Cette coculture au bout de 72h a conduit à l'expression de marqueurs de polarisation des macrophages caractérisant un phénotype M2b. Ainsi nous montrons pour la première fois que : (i) les macrophages créent un microenvironnement contribuant à accélérer, amplifier les réponses métaboliques et inflammatoires des kératinocytes aux agressions chimiques ou infectieuses ; (ii) les kératinocytes exposés au dithianon émettent des signaux solubles qui contribuent à orienter la polarisation des macrophages vers un phénotype immuno-régulateurs, anti-inflammatoires jouant à la fois un rôle protecteur et réparateur mais qui peut aussi être impliqué dans diverses maladies. |
The use of pesticides in agriculture has led to enormous progress in terms of yields, pest and disease vector control. However, epidemiological studies suggest that dermal exposure, ingestion and inhalation of pesticides could affect human health through deregulation of immune system cells. Among these cells, macrophages play a key role in anti-infectious and anti-tumor defense and in the maintenance of cell homeostasis. Dysfunction of any of these functions by pesticides could have serious consequences on the initiation and development of infectious, autoimmune, neurodegenerative diseases and cancers.
The first objective of this thesis consisted in evaluating the impact of 7 pesticides of different chemical classes, used in fruit arboriculture, on the effector functions of human monocyte-derived macrophages (h-MDM). Among these pesticides, only boscalid had no effect. Thiacloprid promoted the ability of macrophages to produce reactive oxygen species (ROS) and IL-10 in response to an inflammatory stimulus. Chlorpyrifos, thiophanate and ziram increased ROS production at low doses (0.01-0.1 µM) while at high doses (10 µM) chlorpyrifos, ziram, captan and dithianon showed immunosuppressive effects by reducing ROS production and pro-inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α). These data suggest that exposure to chlorpyrifos, ziram, captan and dithianon may compromise the elimination of microbial pathogens by macrophages.
The second objective was to determine the mechanism by which ziram (zinc dimethyldithiocarbamate) inhibits the effector functions of macrophages. To assess the role of zinc in the mechanism of action of this fungicide, the effects of ziram were compared to those of disulfiram, (zinc-free dithiocarbamate) whether or not co-incubated with zinc sulfate. We showed that ziram at 10 µM completely inhibited phagocytosis, oxidative hyperactivity and the production of TNF-α, IL-1β, IL-6, CCL2 by macrophages under inflammatory conditions. Disulfiram had the same effects only in combination with zinc sulfate (10 µM). The role of zinc in the effect of ziram was also confirmed by the demonstration of induction in macrophages of the expression of (i) antioxidant genes HMOX1, SOD2, CAT, (ii) marker genes for a polarization of macrophages towards an anti-inflammatory phenotype M2 which is often associated with various diseases related to the suppression of host defenses.
The third objective was to determine dermal exposure to pesticides. Using monoculture and coculture models associating (or not) keratinocytes and hMDM on either side of a permeable membrane, we showed that dithianon at 10 µM, positively regulated TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, TGF-β mRNAs after 48h in monoculture of keratinocytes and after only 24h in coculture with hMDM. We also established that keratinocytes exposed to 10 µM dithianon triggered ROS production by hMDM after 48 and 72 h of coculture. This coculture after 72h led to the expression of macrophage polarization markers characterizing an M2b phenotype. Thus we show for the first time that : (i) macrophages create a microenvironment that contributes to accelerating and amplifying the metabolic and inflammatory responses of keratinocytes to chemical or infectious aggression; (ii) keratinocytes exposed to dithianon emit soluble signals that contribute to orienting the polarization of macrophages towards an immunoregulatory, anti-inflammatory phenotype that plays both a protective and repair role but which may also be involved in various diseases. |