Combiné à la synthèse chimique, l’utilisation de biocatalyseurs offre des opportunités d’accéder à une nouvelle diversité moléculaire. Néanmoins, le manque d'outils enzymatiques possédant les propriétés requises a compliqué l'exploration de voies chimio-enzymatiques pour la synthèse de sucres complexes. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse visent à explorer des stratégies multidisciplinaires et synergiques afin de développer des voies chimio-enzymatiques «programmées» qui tirent parti de la promiscuité de substrat innée et de l’ingénierie assistée par ordinateur des α-transglucosylases. Le but est ainsi de produire des glycobriques, facilement assemblables en molécules biologiquement actives et mimant le fragment polysaccharidique antigénique - O-antigène (O-Ag) - des lipopolysaccharides de Shigella flexneri. Ces derniers ont été identifiés comme étant des cibles majeures de protection contre la réinfection et pourraient être utilisés dans la composition de vaccins de prévention contre la shigellose, une forme endémique de dysenterie bacillaire. De nombreux sérotypes de S. flexneri ont révélé une grande diversité structurelle de leurs O-Ags, qui varient principalement de par la régio-sélectivité de la 1,2-cis α-D-glucosylation. Nous nous sommes concentrés ici sur la structure commune du tétrasaccharide ABCD, définissant l'unité de répétition du squelette de la plupart des O-Ags de S. flexneri. Une version protégée (ABC’D’) a tout d’abord été synthétisée par nos collaborateurs de l’Institut Pasteur. Nous avons ensuite évalué le potentiel des sucrases de branchement (BRS) de la famille 70 des Glycoside Hydrolases pour la glucosylation de ABC’D’. Ces enzymes présentent une grande promiscuité vis-à-vis des substrats accepteurs. Un premier résultat majeur a été obtenu grâce à l’utilisation de 6 enzymes natives dont la capacité à reconnaître et à glucosyler ABC'D' a été démontrée, conduisant à la production et à la caractérisation structurale d'une première glycobrique, ABC'[E(1→6)]D', caractéristique des sérotypes 4a / 4b de S. flexneri.
Par la suite une collection de 22 mutants préexistants de ΔN123-GBD-CD2 a été criblée. En fonction des substitutions d’acides aminés introduites dans le site actif, nous avons observé la redirection de la régio-sélectivité de la glucosylation en comparaison de l’enzyme parentale. Trois produits ont été identifiés, dont une seconde glycobrique, [E(1→3)]ABC’D’, représentative du sérotype prévalent 3a de S. flexneri.
Pour étendre davantage la diversité accessible, nous avons ensuite entrepris de remodeler le site actif d'une BRS à l'aide de méthodes de design d’enzymes assistée par ordinateur. Nous avons mis en place une stratégie associant la modélisation moléculaire et des techniques automatisées de conception de protéines. Un ensemble de 49 séquences contenant jusqu'à 15 mutations a ensuite été proposé et les 49 mutants ont été produits par voie recombinante dans E. coli, puis testés pour la glucosylation de ABC’D’. Les produits ont été caractérisés à l'aide de techniques sensibles telle que la MS-MS. De manière impressionnante, ces mutants produisent jusqu’à six produits mono-glucosylés différents sur les huit possibles, dont une glycobrique, A[E(1→3)]BC’D’, représentative du sérotype 5a de S. flexneri. Au final, nos résultats démontrent la polyvalence des BRS et de leurs mutants pour accéder à une large gamme de profils de glucosylation à partir d’une molécule accepteur commune, le tétrasaccharide ABC’D’. Ces travaux ouvrent également de nouvelles voies pour améliorer les performances catalytiques de ces mutants et pour mieux comprendre les déterminants moléculaires et dynamiques qui pourraient jouer un rôle dans la reconnaissance des accepteurs et leur glucosylation sélective, ce qui pourra offrir de nouvelles possibilités pour la synthèse des haptènes de S. flexneri. |
Combined with chemical synthesis, the use of biocatalysts holds great potential to open the way to molecular diversity. Nonetheless, the lack of appropriate enzymatic tools with requisite properties has hampered extensive exploration of chemo-enzymatic routes to complex carbohydrates. The research work presented in this thesis aimed at exploring multidisciplinary and synergistic strategies to develop “programmed” chemo-enzymatic pathways that take advantage of innate substrate promiscuity and computer-aided engineering of α-transglucosylases to produce glycobricks, easy-to-assemble into biologically active molecules mimicking the antigenic polysaccharide moiety – O-antigen (O-Ag) – of the Shigella flexneri lipopolysaccharides. These latter have been identified as major targets of protection against reinfection and could be used in the composition of vaccines to prevent shigellosis, an endemic form of bacillary dysentery. Many S. flexneri serotypes presented a tremendous O-Ag structural diversity, varying mainly in the regio-selectivity of the 1,2-cis α-D-glucosylation. We focused herein on the common structure of the ABCD tetrasaccharide defining the backbone repeating unit of most S. flexneri O-Ags. A lightly protected ABC’D’ was first chemically synthesized by our collaborators from the Pasteur Institute. Next, we evaluated the potential of branching sucrases (BRS) from the Glycoside Hydrolase family 70 to glucosylate ABC’D’. They present the advantage of displaying a large promiscuity toward acceptor substrates.
A first achievement was reached using 6 native BRS enzymes whose ability to recognize and glucosylate ABC’D’ was shown, leading to the production and the structural characterization of a first glycobrick, ABC’[E(1→6)]D’, representative of S. flexneri serotypes 4a/4b.
Then a collection of 22 pre-existing mutants of ΔN123-GBD-CD2 was screened. Depending on the amino acid substitutions introduced in the active site, the glucosylation regio-selectivity was redirected compared to parental enzyme. Three products were identified, of which a second glycobrick, [E(1→3)]ABC’D’, is representative of prevalent S. flexneri serotype 3a.
To further enhance the accessible diversity, we then decided to purposely redesign the active site of a branching sucrase using computer-aided engineering methods. We followed a computational framework combining molecular modelling and automated computational protein design techniques. A set of 49 sequences containing up to 15 mutations was then proposed and the 49 mutants were recombinantly produced in E. coli, then assayed for glucosylation of ABC’D’. Products were characterized using sensitive MS-MS techniques. Impressively these mutants produced as much as six different mono-glucosylated products out of the eight possible ones, of which one glycobrick, A[E(1→3)]BC’D’, is representative of S. flexneri serotype 5a.
Overall, our results demonstrate the versatility of branching sucrases and their mutants to access a broad range of glucosylation patterns from a common tetrasaccharide acceptor molecule, ABC’D’. It also opens new paths for improving catalytic performances of these mutants and better understanding molecular and dynamical determinants that could play a role in acceptor recognition and its site-selective glucosylation that will hopefully offer new opportunities for the synthesis of S. flexneri haptens. |