La Cytolethal Distending Toxin (CDT) est un facteur de virulence produit par de nombreuses bactéries pathogènes Gram-négatives. La CDT est impliquée dans la pathogénicité des bactéries productrices, et promeut la persistance à long terme de l’infection et de l’inflammation. De plus, la CDT est capable d’endommager l’ADN des cellules infectées, ce qui la caractérise comme étant une génotoxine. La CDT induit donc à de l’instabilité génétique qui, en synergie avec la promotion de l’inflammation, est probablement à l’origine de l’association constatée entre CDT et cancérogénèse. L’action de la toxine repose sur la sous-unité catalytique CdtB, mais des doutes persistent sur son mode d’action exact.
En effet, sur la base d’alignements de séquence et structure avec la DNase I, il a été suggéré que la sous-unité CdtB est une nucléase et que son activité est évaluable par un test in vitro de dégradation d’un plasmide bactérien. Ce test est largement utilisé dans la littérature, mais des incohérences dans l’activité nucléase mesurée ont été rapportées. D’autre part, des alignements de séquence avec certaines phosphatases ciblant des phosphoinositides ont permis d’envisager une activité similaire pour la CdtB. Cependant, l’importance respective de chacune de ces deux activités biochimiques dans la toxicité de CDT n’est pas bien caractérisée, et, de manière plus générale, leur impact sur les pathologies associées à CDT est également peu compris à ce jour.
Afin de mieux caractériser les activités biochimiques de CdtB, nous avons généré et utilisé diverses toxines mutantes. Dans une première étude, une comparaison des effets cellulaires et du test de digestion de plasmide in vitro a permis de déterminer que ce dernier est inadapté à l’étude de l’activité biochimique de CdtB. Suite à ce travail, nous suggérons l’utilisation de tests cellulaires, reposant particulier sur l’évaluation de la réponse aux dommages à l’ADN induite par CDT, pour définir l’activité de la toxine. Dans un second temps, ces tests cellulaires ont été utilisés pour évaluer l’impact de différentes mutations sur l’activité de CdtB. Une partie de ces mutations a eu pour but de découpler les deux activités, nucléases et phosphatases, en ciblant notamment des résidus potentiellement impliqués dans la liaison aux substrats. Grâce à ces mutants, nous avons déterminé que la toxicité est principalement liée à l’activité nucléase tandis que l’activité phosphatase est probablement impliquée dans le transport intracellulaire de la toxine. Les autres mutants générés ciblaient une région strictement conservée avec une endonucléase humaine présentant des caractéristiques similaires à CdtB, et les résultats préliminaires sont présentés.
Enfin, une dernière partie de ma thèse portait sur l’étude de l’impact de CDT sur le déroulement du cycle cellulaire et sur l’instabilité génomique. Ce projet, basé sur l’utilisation d’une technique d’imagerie en temps réel de cellules vivantes, a mis en évidence l’induction par CDT de défauts en mitose, et plus particulièrement un allongement de la transition métaphase / anaphase.
En conclusion, ce travail de thèse a permis d’une part de mieux caractériser les liens entre activités biochimiques de CdtB et effets toxiques de CDT, et d’autre part d’étudier son implication dans l’induction d’instabilité génomique. De manière générale, cette caractérisation du mode d’action de CDT représente une première étape vers une meilleure compréhension de la pathogénèse qu’elle induit |
The Cytolethal Distending Toxin (CDT) is a virulence factor produced by several Gram-negative pathogenic bacteria. CDT is involved in the pathogenicity of producing bacteria and promotes long-term persistence of infection and inflammation. Moreover, CDT can to induce DNA damage in infected cells, classifying CDT as a genotoxin. CDT thus induces genomic instability which, concomitantly with inflammation promotion, is probably the cause of the reported association between CDT and carcinogenesis. The effects of the genotoxin rely on the CdtB catalytic subunit, but uncertainty however persists on its exact mode of action.
Based on sequence and structure alignment with DNase I, CdtB has been proposed to be a nuclease and its activity is supposedly measureable by an in vitro bacterial plasmid degradation assay. This test has been largely used in literature, but inconsistencies have been reported in nuclease activity evaluation. Moreover, sequence alignment with specific phosphatases targeting phosphoinositides suggested a similar activity for CdtB. However, the significance of each biochemical activity on CDT toxicity is not yet characterized, and overall, their impacts on CDT-associated pathologies are not well understood to this day.
In order to characterize the biochemical activities of CdtB, we generated and used several mutated toxins. In a first study, comparison between cellular effects and in vitro plasmid digestion assay determined that this test is unsuited to study CdtB biochemical activity. We instead propose to use cellular assays relying on the evaluation of CDT-induced DNA damage response. These tests were then used to evaluate the impact of different mutations on CdtB activity. Most of these mutations aimed to decouple both activities, especially by targeting residues potentially involved in substrates binding. The mutants allowed to determine that toxicity is mainly linked to nuclease activity while phosphatase activity is probably involved in intracellular trafficking of the toxin. Other generated mutants targeted a region strictly conserved with a human endonuclease presenting similar characteristic with CdtB, and preliminary results are presented.
Finally, the last part of my thesis focused on the study of CDT impact on cell cycle and genomic instability. This project, based on a live-cell time-lapse microscopy approach, highlighted the CDT-induced mitotic defaults, especially an increase of metaphase/anaphase transition duration.
In conclusion, this thesis permitted firstly to better characterize the relationship between CdtB biochemical activities and CDT toxic effects, and secondly to study its participation in genomic instability induction. Overall, this characterization of CDT mode of action represents a first step to get more insight on the pathogenesis it can induce. |