Au sein de la moelle osseuse (MO), les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont logées dans un microenvironnement en 3D spécialisé, appelé « niche », régulant leur comportement (e.g. auto-renouvellement, engagement vers les lignages, prolifération et survie). Cette niche est composée de plusieurs cellules comme les cellules endothéliales vasculaires, périvasculaires et ostéoblastiques. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) périvasculaires jouent un rôle clé dans la formation de ce microenvironnement, tant par leur expression de facteurs pro-hématopoïétiques, que de leur capacité de différentiation vers le lignage ostéoblastique. Ainsi, les sous-populations de CSM composant cette niche sont impliquées dans la régulation de l’hématopoïèse, mais également dans la formation et la régénération du squelette.
Récemment décrites chez la souris à l’échelle de la cellule unique, les sous-populations de CSM restent cependant inexplorées dans la MO humaine, ainsi que leur rôle respectif dans la niche. Connaître l’identité de ces sous-populations, déchiffrer leurs propriétés natives et recréer ex vivo ces niches physiologiques en 3D restent des enjeux scientifiques majeurs pour la compréhension de l’hématopoïèse et de l’ostéogenèse humaine.
Dans ce travail, nous avons dans un premier temps, utilisé des approches de séquençage d'ARN à l’échelle de la cellule unique (scRNAseq), afin de caractériser chaque population stromale de la MO humaine et de découvrir des facteurs de niche hématopoïétiques clés hautement conservés entre les espèces. Nous avons ainsi identifié plusieurs sous-populations cellulaires, exprimant différents gènes régulateurs de l’hématopoïèse, comprenant des cellules endothéliales, des cellules murales et particulièrement des CSM ayant des trajectoires ostéoblastiques et adipogéniques distinctes. De manière intéressante, nos données suggèrent une hiérarchie de différenciation à branchement simple avec la présence d’un sous-ensemble multipotent, que sont les cellules réticulaires abondantes en CXCL12 (CAR) à l’origine des autres sous-populations de CSM. Nous avons confirmé un enrichissement des cellules CAR exprimant le récepteur à la leptine (LEPR) dans la fraction native CD45- / CD271+ / CD200+, ainsi que leur localisation in situ en utilisant des approches histologiques sur des biopsies humaines.
Dans un deuxième temps, nous avons élaboré une méthode d'isolation ex vivo pour préserver et amplifier les cellules CAR de la MO, puis étudié leur auto-organisation en culture 3D. Nous avons constaté que les sphéroïdes dérivés des cellules de type CAR ont une angiogenèse très soutenue, sécrètent des cytokines pro-niche et récapitulent spontanément in vitro la formation osseuse intramembranaire précoce. Grâce à des modèles bio-informatiques et des techniques d'édition du génome, nous avons mis en évidence le rôle de la protéine WDR35 et du cil primaire dans la différenciation ostéoblastique médiée par les voies de signalisation Hedgehog et Wnt. Enfin, nous avons montré que la xénotransplantation ectopique de ces sphéroïdes pouvait donner naissance à des ostéoblastes humains matures, tout en formant une niche aux CSH après humanisation hématopoïétique de souris immunodéprimées NSG.
Pour la première fois, nous avons cartographié le stroma de la MO humaine avec une résolution unicellulaire et démontré que les cellules CAR cultivées en 3D représentent un nouvel outil utile en recherche fondamentale comme en médecine régénérative. |
Within the bone marrow (BM), hematopoietic stem cells (HSC) homed in a specialized 3D microenvironment, called a "niche", regulating their behavior (e.g. self-renewal, commitment to lineages, proliferation and survival). This niche is composed of several cells such as vascular endothelial, perivascular, and osteoblastic cells. Perivascular mesenchymal stromal cells (MSCs) play a key role in the formation of this microenvironment, both through their expression of pro-hematopoietic factors, and their ability to differentiate towards osteoblastic lineage. Therefore, MSCs sub-populations are highly involved in the regulation of hematopoiesis, but also bone formation and regeneration.
Recently described in mice at the single-cell level, BM MSCs subsets remain unexplored in humans, as well as their respective roles in the niche. Knowing the identity of these sub-populations, deciphering their native properties, and recreating ex vivo these physiological niches in 3D, remain as major scientific challenges for understanding human hematopoiesis and osteogenesis.
Here, we first single-cell RNA sequencing approaches to characterize the human BM stroma and uncover key hematopoietic niche factors highly conserved between species. We have thus identified subsets expressing different hematopoietic regulatory genes spanning endothelial cells, mural cells, and especially MSCs with distinct osteoblastic and adipogenic trajectories. From interest, our data suggest a simple branching differentiation hierarchy with the presence of a multipotent subset: the CXCL12-abundant reticular (CAR) cells at the origin of the other MSCs subpopulations. We confirmed the enrichment of the CXCL12-abundant reticular (CAR) cell subset expressing the Leptin receptor (LEPR+) in the CD45-/CD271+/CD200+ BM fraction as well as their in situ localization using histology approaches on human biopsies.
Secondly, we developed an ex vivo isolation method to preserve and amplify the BM CAR cells, then studied their self-organization in 3D culture. We found that CAR derived spheroids highly sustained angiogenesis, secreted HSC niche cytokines, and spontaneously recapitulates early intramembranous bone formation in vitro. Using bioinformatics models and genome editing techniques, we highlighted the role of the WDR35 protein and the primary cilia in osteoblastic differentiation mediated by the Hedgehog and Wnt signaling pathways. Finally, we have shown that ectopic xenotransplantation of these spheroids could give rise to mature human osteoblasts while forming a niche for HSCs after hematopoietic humanization of immunocompromised NSG mice.
For the first time, we have mapped the human BM stroma at a single-cell resolution and demonstrated that CAR cells cultured in 3D represents a new tool useful in basic research as well as in regenerative medicine. |