Les modèles en 3D occupent une place de plus en plus importante en biologie cellulaire et en ingénierie tissulaire. Ils offrent de nombreux avantages pour la compréhension des processus physiopathologiques et ouvrent ainsi de nombreux champs d’investigation dans le domaine biomédical (neurosciences, biologie du cancer, pathologie cardiovasculaire…). Pour mieux comprendre les processus qui régissent le développement de ces structures assimilées à des tissus (TM) ou encore des organes et leur interaction en situation normale ou pathologique, il faut déterminer comment les cellules s’organisent, interagissent dans leur environnement en trois dimensions et comment les contraintes environnementales influencent cette réponse. La microscopie à feuille de lumière et plus particulièrement, le Selective Plane Illumination Microscope (SPIM), un de ses variants, représente un outil de choix pour observer et imager avec une haute résolution spatio-temporelle des TM tout en maintenant leur viabilité à long terme.
Bien que le SPIM représente aujourd’hui une technique de choix pour l’imagerie du vivant à long terme des TMs, il souffre de phénomènes tels que la diffusion, l'absorption et les aberrations optiques qui limitent la profondeur à laquelle une imagerie utile peut être réalisée, généralement pas au-delà de 100 µm.
L’optique adaptative (AO), de plus en plus utilisée dans le domaine de la microscopie à fluorescence, est une technique capable d’améliorer la qualité d’imagerie en profondeur en corrigeant les aberrations optiques introduites par l’échantillon. Les systèmes AO basés sur les capteurs de front d’onde nécessitent généralement l'utilisation d'un point source émetteur de lumière appelé étoile guide. En microscopie, l’utilisation de la fluorescence à deux photons permet de produire une étoile guide non linéaire (NGS) dans n'importe quelle région du champ de vision.
Pour ce travail de thèse, j'ai implémenté dans un SPIM un système d’AO constitué d’un capteur de front d'onde et d’un miroir déformable, capable de corriger les aberrations dans les TMs optiquement épais tels que les sphéroïdes tumoraux multicellulaires (MCTS). Un capteur de front d'onde de type Shack-Hartmann à haute sensibilité (SHWFS) a été développé à façon afin de permettre la reconstruction du front d’onde et sa correction à partir de la faible quantité de fluorescence produite par les NLG en profondeurs dans les MCTS. Au cours de ce travail, j’ai tout d’abord caractérisé les performances de ce SHWFS et dans un deuxième temps j’ai évalué la capacité du système à corriger les aberrations dans diverses conditions, y compris à l'intérieur de TMs.
J’ai observé des améliorations sans précédent de la qualité d'image en profondeur des MCTS, en termes de détails et de résolution haute-fréquence. Grâce à ces corrections, j’ai pu mettre en évidence des évènements biologiques tels que des mitoses non visibles sans corrections.
Les « up converting » nanoparticules (UPCNP) sont des particules de terres rares capables de subir une conversion ascendante de photon lorsqu'elles sont illuminées, émettant une lumière d'une longueur d'onde plus courte que celle de l'éclairage. Les étoiles guides en UPCNP sont particulièrement intéressantes en raison de la possibilité qu’elles soient excitées dans l’infrarouge proche tout en émettant de la lumière visible, ce qui réduit le photodommage produit par la lumière d’éclairage. La possibilité d’utiliser des UPCNP comme étoiles guides dans des échantillons biologiques a été explorée dans cette thèse.
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In recent years, tissue mimics (TMs) such as microtissues, spheroids, and organoid cultures have become increasingly important in life-science research, as they provide a physiologically relevant environment for cell growth, tissue morphogenesis, and stem cell differentiation. Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) is one of the most prominent microscopy modalities for three-dimensional tissue imaging, and a sine que non tool to understand cell biology in TMs. However, while SPIM is regarded as a very powerful tool for TM imaging, optical microscopy suffers from certain limitations when imaging 3D samples. Indeed, scattering, absorption and optical aberrations limit the depth at which useful imaging can be done, typically no more than 100 µm.
Adaptive Optics (AO) is a technique capable of improving image quality at depth by correcting the optical aberrations introduced by the sample which is seeing increasing used in fluorescence microscopes. Wavefront sensor AO schemes usually require the use of a point source of light know as a guide star. Two-photon fluorescence provides us with a tool to produce a faint non-linear guide star (NGS) in any region of the field of view.
For this thesis, I have incorporated a wavefront sensor AO scheme to SPIM, able to correct aberrations in optically thick TMs such as multi-cellular tumor spheroids (MCTS). Due to the low amount of light produced by NGSs such as the one used in our system, a custom high-sensitivity Shack-Hartmann wavefront sensor (SHWFS) was developed for our needs. In this work, I characterize the performance of this SHWFS and the ability of our system to correct aberration in various conditions, including inside TMs.
I show unprecedented image quality improvements for in-depth imaging of MCTS, in regard of high-frequency detail and resolution. This allowed us to identify biologically relevant features at depths inaccessible to conventional SPIM.
Up-converting nanoparticles (UPCNP) are rare-earth based particles that are able to undergo photon up-conversion when illuminated, emitting light of a shorter wavelength than that of the illumination. Guide stars made from UPCNP are especially attractive due to the possibility of them being excited in the near-infrared while emitting visible light, reducing photodamage produced by the illumination light. The viability of using UPCNP as guide stars in biological samples in explored in this thesis.
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