La séparation par taille des acides nucléiques est un processus important, couramment utilisé pour le diagnostic, l'analyse médico-légale et le séquençage. Ce processus est régulièrement effectué à l’aide de gels en plaques dans les laboratoires de recherche et par électrophorèse capillaire pour des analyses à haut débit dans les laboratoires de médecine légale. Dans un souci de simplification, de réduction des coûts et d’accélération de l’analyse, des technologies de micropuces remplissant la même fonction ont été développées. Ils offrent une réduction du temps d'analyse, de la consommation d'échantillons, du coût et de la main-d'œuvre, ainsi que la portabilité, l'automatisation et le multiplexage. Aujourd'hui, avec l'avancée des technologies de micro et nanofabrication, des dizaines d'études émergent chaque année sur de nouveaux dispositifs de séparation par micropuces pour les acides nucléiques, les protéines, les particules, les cellules, les biovésicules, etc. gammes de taille spécifiques.
Nos travaux portent sur le développement d’une technologie de micropuce pour la séparation des acides nucléiques; molécules d'ADN double brin de différentes tailles, ADN et ARN simple brin. La technologie appelée «µLAS» a été créée en 2016. Elle fonctionne sur le principe du fractionnement et de la concentration simultanés d'acides nucléiques dans un dispositif microfluidique utilisant un actionnement électro-hydrodynamique en opposition dans une matrice de tamisage polymère viscoélastique. Le groupe avait démontré l’utilisation de la technologie pour le fractionnement de l’ADNdb sur une plage de 300-50000 bp1 et son application pour le diagnostic de la maladie de Huntington et l’analyse de l’ADN en circulation. Des développements ultérieurs ont étendu la plage de séparation à 100 Kbp en utilisant des formats de micropuce et capillaire. Dans le format capillaire, la technologie effectue une analyse rapide de l’ADN en circulation avec une limite de détection basse, en concurrence avec les dispositifs classiques d’électrophorèse capillaire. La technologie a également été utilisée pour l'isolement de l'ADN de fragments de génome de plantes longues et la sélection et l'extraction de tailles de fragments d'ADN spécifiques pour le séquençage4.
Dans le cadre de ma thèse, j'ai travaillé sur l'optimisation de la technologie µLAS au format puce, afin de réduire la plage de tailles de séparation aux molécules d'ADN inférieures à 300 pb et de réaliser la séparation des molécules d'ARN. Cette optimisation a nécessité la modélisation du fractionnement en fonction de l’actionnement électro-hydrodynamique bidirectionnel dans les écoulements viscoélastiques et l’étude de la géométrie de la micropuce, de différentes formulations de matrice polymère et de paramètres d’actionnement. Après une vue d'ensemble de toutes les techniques de séparation des micropuces, µLAS s'est avéré être à la pointe de la technologie et faire concurrence à d'autres technologies. Un modèle analytique a été conçu pour expliquer le principe de fonctionnement de µLAS, qui capture avec précision les données expérimentales. En outre, l’optimisation de la technique de fabrication de la micropuce permet un fractionnement en une étape de 0,5 à 150 Kbp et de haute efficacité en moins de 5 min. |
Nucleic acids size-separation is an important, routinely used process for diagnosis, forensic analysis, and sequencing. This process is regularly performed using slab gels in research laboratories and using capillary electrophoresis for high throughput analysis in forensic laboratories. In attempts to simplify, reduce the cost and speed up the analysis, microchip technologies, that perform the same function, have been developed. They offered reduced analysis time, sample consumption, cost, and labor in addition to portability, automation and multiplexing. Today, with the advancement of micro and nanofabrication technologies, tens of studies emerge every year on new microchip separation devices for nucleic acids, proteins, particles, cells, bio-vesicles etc. Using different physical principles, each could separate specific types of molecules or specific size ranges.
Our work discusses the development of a microchip technology for the separation of nucleic acids; double stranded DNA molecules of different size ranges, single stranded DNA and RNA. The technology called “µLAS” has been created in 2016. It works on the principle of simultaneous fractionation and concentration of nucleic acids in a microfluidic device using opposing electro-hydrodynamic actuation in a viscoelastic polymer sieving matrix. The group had demonstrated the use of the technology for the fractionation of dsDNA over the range of 300-50000 bp1 and the application of the technology for diagnosis of Huntington’s disease and the analysis of circulating DNA . Further developments have extended the separation range to 100’s of Kbps using microchip and capillary formats. In the capillary format, the technology performs fast analysis of circulating DNA with low limit of detection , competing with standard capillary electrophoresis devices. The technology has also been used for DNA isolation of long plant genome fragments and the tunable selection and retrieval of specific DNA fragment sizes for sequencing4.
In the framework of my PhD, I have worked on the optimization of the µLAS technology in microchip format, to reduce the separation size range to DNA molecules smaller than 300 bp as well as realize the separation of RNA molecules. This optimization required the modeling of the size fractionation using the bidirectional electro-hydrodynamic actuation in viscoelastic flows and working on the microchip geometry, different polymer matrix formulations, and actuation parameters. After an overview of all microchip separation techniques, µLAS proved to be at the state of the art and competes with other technologies. An analytical model has been devised to explain the working principle of µLAS, which accurately captures the experimental data. Furthermore, optimization of the microchip fabrication technique allows high efficiency single step fractionation of 0.5-150 Kbp in less than 5 min. |