La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est un type de cancer du sang, développé à partir de cellules transformées en globules blancs. Des études ont démontré que les cellules AML exprimant le récepteur de tyrosine kinase 3 de type Fms (FLT3) -duplication tandem interne (ITD) sont plus sensibles à l'inhibition du protéasome que les wild type, et que cette cytotoxicité est induite par l'autophagie. L'inhibition de l'autophagie bloque la dégradation de FLT3-ITD induite par l'inhibiteur du protéasome Bortezomib (Bz) et augmente LC3-II. Il a été proposé que ces effets de cytotoxicité de Bz soient médiés par l’inhibition des voies comme (MAPK) / (ERK), PI3K /AKT et STAT5.Mon projet vise à comprendre comment l’autophagie contribue à réguler la cytotoxicité dans les LMA après l’inhibition du protéasome. Afin d'explorer les mécanismes moléculaires régulant la diaphonie entre les deux voies protéolytiques, nous étudions le rôle des événements d'autophagie sélective. Dans les conditions de stress protéotoxiques générées par Bz, nous avons trouvé parmi les voies les plus remarquables, la proteaphagie. La proteaphagie a été signalée pour la première fois chez Arabidopsis et dans la levure, en tant que processus par lequel le protéasome est dégradé par autophagie après une inhibition du protéasome ou une privation nutriments. En utilisant différents inhibiteurs du protéasome ou de l'autophagie et plusieurs approches expérimentales, y compris l'analyse par immunofluorescence et Western blot, nous avons constaté que les sous-unités du protéasome 20S et 19S, étaient dégradées après l'inhibition du protéasome, mais dans des proportions différentes sur les cellules FLT3-ITD positives ou WT. Ce processus de dégradation est bloqué par des inhibiteurs de l’autophagie. Nos résultats indiquent que cette voie d'autophagie sélective a été activée dans des cellules AML positives FLT3-ITD dans des conditions de stress protéotoxiques. Mais, la proteaphagie n'est pas activée dans les cellules WT, ce qui suggère un lien entre la proteaphagie et le phénotype FLT3-ITD.
Pour étudier les mécanismes moléculaires régulant la proteaphagie, nous avons utilisé la vertéporfine (VP), un médicament approuvé par la FDA, qui empêchent la formation d'autophagosomes. Contrairement à la bafilomycine A (BafA), la VP inhibe l'autophagie à un stade précoce, ne permet pas l'accumulation d'autophagosomes et inhibe l'autophagie in vitro avec une IC50 de 1µM. Cette stratégie nous a permis de confirmer l'implication du récepteur de l'autophagie p62 dans la proteaphagie observée dans les cellules AML positives FLT3-ITD.
Nous avons utilisé des pièges moléculaires pour capturer les protéines ubiquitylées connues sous le nom de TUBE (Tandem Ubiquitin Binding Entities) afin d’étudier la participation de l’ubiquitine. Les pièges capturent les protéines ubiquitylées endogènes avec une affinité et une spécificité élevée. Nous avons capturé les protéines ubiquitylées de cellules AML positives FLT3-ITD en utilisant des TUBE basés sur le récepteur de l'autophagie p62 (TUBE-p62) ou un TUBE basé sur le récepteur du protéasome humain (HR23A). Nos résultats suggèrent que les protéines ubiquitylées capturées avec les TUBE sont distinctes. HR23A capture le FLT3 ubiquitylé uniquement dans des conditions d'inhibition du protéasome, mais pas dans des conditions d'inhibition de l'autophagie. TUBE-p62 capture le FLT3-ITD non modifié lorsque l’autophagie est bloquée. Ces résultats indiquent que la participation de Proteasome et d'Autophagie à la dégradation de FLT3-ITD est en fonction de la voie inhibée dans ces cellules AML. Ces résultats suggèrent que la proteaphagie pourrait contribuer à la cytotoxicité observée dans les cellules FLT3-ITD positive après l’inhibition du protéasome. Cette sensibilité pourrait être utilisée pour améliorer les traitements actuels si nous comprenons comment des facteurs cruciaux tels que STAT5, ERK ou AKT sont également affectés de manière négative dans ces cellules. |
Acute myeloid leukemia (AML) is a type of blood cancer, developed from cells that turn into white blood cells. Previous studies demonstrated that AML cells expressing the Fms-like tyrosine kinase 3 receptor (FLT3)-Internal Tandem Duplication (ITD) are more sensitive to proteasome inhibition than wild type samples and this cytotoxicity is mediated by autophagy.
Indeed, the autophagy inhibition blocks FLT3-ITD degradation induced by the proteasome inhibitor Bortezomib (Bz), and increased LC3-II levels. This cytotoxicity effects of Bz was proposed to be mediated by the inhibition of MAPK/ERK, PI3K/AKT and STAT5 pathways.
My project aims to understand how autophagy contribute to regulate cytotoxicity in AML after proteasome inhibition. In order to explore the molecular mechanisms regulating the crosstalk between both proteolytic pathways, we investigate the role of selective autophagy events. Under proteotoxic stress conditions generated by Bz, we found among the most remarkable pathways, proteaphagy. Proteaphagy was first reported in Arabidopsis, and yeast, as a process by which the proteasome is degraded by autophagy after proteasome inhibition or amino acid starvation. Using different chemical inhibitors of the proteasome or autophagy, and several experimental approaches including immunofluorescence and Western blot analysis, we found that proteasome subunits from the 20S catalytic core and 19S of the regulatory subunit were degraded after proteasome inhibition, but in a different proportion in relation with FLT3-ITD positive or WT AML cells. This degradation process is blocked by distinct autophagy inhibitors. Our results indicate that this selective autophagy pathway was activated in FLT3-ITD positive AML cells under proteotoxic stress conditions. In contrast, proteaphagy is not activated in WT AML cells under the same conditions, suggesting a link between proteaphagy and FLT3-ITD phenotype.
To investigate the molecular mechanisms regulating proteaphagy, we used Verteporfin (VP), an FDA-approved drug that was identified in a screen for chemicals that prevent autophagosome formation. Unlike Bafilomycin A (BafA), Verteporfin inhibits autophagy at an early stage, does not allow autophagosome accumulation, and it inhibits autophagy in vitro with an IC50 of 1µM, making Verteporfin interesting for our study. This strategy helped us to confirm the implication of the autophagy receptor p62 in the proteaphagy observed in FLT3-ITD positive AML cells.
We also used molecular traps to capture ubiquitylated proteins known as TUBEs (for Tandem Ubiquitin Binding Entities) to investigate the participation of ubiquitin in this proteolytic crosstalk. TUBEs capture endogenous ubiquitylated proteins with high affinity and specificity. We captured ubiquitylated proteins from FLT3-ITD positive AML cells using TUBEs based on the autophagy receptor p62 (TUBE-p62) or a TUBE based on the human proteasome receptor (HR23A). Our results suggest that ubiquitylated proteins captured with the different TUBEs are distinct. In particular, HR23A captures ubiquitylated FLT3 only under proteasome inhibition condition, but not under autophagy inhibition condition. On the other hand, TUBE-p62 trap captures unmodified FLT3-ITD only when autophagy is blocked. These results indicate the participation of both Proteasome and Autophagy in the degradation of FLT3-ITD depending on the pathway is inhibited in these AML cells.
Altogether these results suggest that proteaphagy might contribute to cytotoxicity observed in FLT3-ITD positive cells after proteasome inhibition. This sensitiveness could be used to improve actual treatments if we understand how crucial factors such as STAT5, ERK or AKT, are also negatively affected in these cells. |