Objectifs :
L’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est défini par une importante réaction desmoplasique, dont les fibroblastes normaux résidents du pancréas, appelés cellules stellaires pancréatiques (PSC), qui s’activent en fibroblastes associés au cancer (CAF), sont les cellules majoritaires. Les CAF, de par leurs sécrétions de facteurs solubles et insolubles de la matrice extracellulaire, sont impliqués dans la progression et la chimiorésistance du PDAC. Deux sous-populations majoritaires de CAF ont été décrites : Des CAF bénéfiques freinant la pathologie et aux propriétés contractiles, et d’autre part des CAF inflammatoires délétères qui sécrètent de nombreuses cytokines pro-tumorales. Notre projet a pour objectif de rechercher le rôle de FKBP7, une co-chaperonne du réticulum endoplasmique (RE), dans l’acquisition du phénotype activé sécrétoire des PSC, afin de mieux comprendre l’établissement de ces sous-populations de CAF pancréatiques.
Résultats :
Nous démontrons que les PSC activées et les CAF synthétisent majoritairement des protéines membranaires et sécrétées transitant par le RE, alors que les cellules cancéreuses produisent essentiellement des protéines cytosoliques. De plus, en association avec cette synthèse importante de facteurs sécrétés, les PSC et les CAF sont résistants au stress du RE en comparaison aux lignées cancéreuses pancréatiques. La comparaison des transcriptomes des tumeurs et du stroma de PDX, nous a permis d’identifier FKBP7, une co-chaperonne du RE régulant la synthèse protéique, comme étant surexprimé dans le stroma et plus particulièrement dans les PSC activées et les CAF, comparé aux cellules cancéreuses. Nous montrons aussi que l’expression de FKBP7 est augmentée in vitro durant l’activation des PSC en aval du TGFβ, mais aussi de la mécano-transduction de façon dépendante de la phosphorylation de FAK. Nous avons confirmé in vivo que l’expression de FKBP7 est augmentée au cours de l’activation des PSC au cours de la pancréatite chez la souris et l’Homme.
Fonctionnellement, nous démontrons que FKBP7 n’est pas impliqué dans le phénotype de résistance des PSC activés et des CAF aux stress du RE. A l’aide de différentes PSC dans lesquelles nous modulons l’expression de FKBP7, nous montrons que FKBP7 réduit le nombre de fibres de stress contractiles et la phosphorylation de FAK dans les PSC, ce qui a pour conséquence d’inhiber leurs capacités contractile et migratoire. Etant donné que cette co-chaperonne du RE interagit et inhibe l’activité ATPasique de BIP, une des principales chaperonnes du RE, nous avons émis l’hypothèse que FKBP7 pouvait modifier le sécrétome des PSC activées. Nous démontrons que FKBP7 régule finement le sécrétome des PSC en promouvant la sécrétion de la thrombospondine-1, mais en diminuant la sécrétion des petites cytokines inflammatoires comme l’IL6, l’IL8 et l’IL23. In vivo, nous démontrons que FKBP7 participe aux propriétés anti-tumorales des PSC, puisque la progression tumorale de co-xénogreffes comprenant des cellules tumorales et des PSC invalidées pour FKBP7 est diminuée par rapport à celle comprenant des PSC contrôles.
Conclusion :
Ce travail de thèse identifie une voie du RE mettant en jeu la co-chaperonne FKBP7 dans l’inhibition du phénotype pro-tumoral contractile et pro-inflammatoire des fibroblastes. En outre, il démontre que le phénotype contractile des fibroblastes co-existe avec leurs propriétés de sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. |
Objectives:
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is characterized by a prominent desmoplastic reaction, where “normal” pancreatic resident fibroblasts named pancreatic stellate cells (PSC), get activated into cancer-associated fibroblasts (CAF), which represent the most abundant stromal cells. CAF secrete soluble and extracellular matrix proteins involved in PDAC progression and chemoresistance. Two main CAF subpopulations were reported to co-exist: Beneficial CAF with contractile properties and deleterious inflammatory CAF which secrete cytokines. Our project aims at understanding the role of FKBP7, an endoplasmic reticulum (ER) co-chaperone in the acquisition of the PSC activated phenotype, in order to better understand the establishment of these two CAF subpopulations.
Materials and methods:
Transcriptomic analyses were performed on published PDAC RNAseq databases, and immunohistochemistry analyses on patient PDX (patient-derived xenografts) and pancreatitis tissues, and murine models of PDAC and pancreatitis. Subcellular localization of protein synthesis was assessed using the SUnSET assay in cancer cell lines and immortalized PSC and CAF. The activated PSC phenotype was studied using PSC and CAF, knocked-down or overexpressing FKBP7 (transduction using lentivectors comprising shRNA targeting FKBP7 or its cDNA). To do so, we performed electron scanning and immunofluorescence confocal or HCS (high-content screen) microscopy, and collagen gel contraction and scratch wound healing assays to measure cell contractility or migration, respectively. Cell secretory profiles were analyzed by membrane cytokine arrays. In vivo impact of the ER co-chaperone was investigated upon orthotopic co-xenografting of cancer cells with PSC knockdown for its expression.
Results:
We showed that PSC and CAF mainly synthesize membrane and secreted protein transiting through the ER, whereas pancreatic tumor cells mostly produce cytosolic proteins. In addition to their phenotype of high synthesis of secreted factors, PSC and CAF are resistant to ER stress as compared to tumor cells. Comparative transcriptomics performed on PDX tumor epithelium versus stroma compartments, enabled to identify FKBP7, a protein synthesis regulating factor and ER co-chaperone overexpressed in PDAC stroma, and more specifically in PSC and CAF as compared to tumor cells. We showed that FKBP7 expression is increased during PSC activation in vitro by TGFβ, as well as downstream of a FAK-dependent mechano-signaling. We confirmed in vivo that FKBP7 expression is increased when PSC get activated, at the onset of murine and human pancreatitis and of murine PDAC.
Functionally, we demonstrated that FKBP7 is not involved in the ER stress-resistant phenotype of PSC and CAF. Through FKBP7 expression modulation in PSC or CAF, , we showed that FKBP7 decreases the number of contractile stress fibers and FAK phosphorylation in PSC, which was associated with an alteration of their contractile and migratory features. Since this ER co-chaperone interacts and inhibits BIP ATPase activity, one of the main ER chaperone, we hypothesized that it modifies PSC secretome. We showed that FKBP7 finely tunes PSC secretome by promoting the secretion of thrombospondin-1, but decreasing the secretion of small inflammatory cytokines (IL6, IL8, IL23). In vivo, we showed that FKBP7 is critical for restraining activated PSC pro-tumoral features, since the intra-pancreatic xenografts of tumor cells with PSC knocked-down for FKBP7 demonstrated increased tumor progression, as compared to xenografts of tumor cells with control PSC.
Conclusion:
In conclusion, this work identifies an ER pathway involving the co-chaperone FKBP7 in restraining the acquisition by PSC of pro-tumoral contractile and pro-inflammatory features. Importantly, it therefore demonstrates that pro-tumoral features of contractility and of pro-inflammatory secretion co-exist in activated PSC. |