Les plantes ont la capacité de s'associer avec des microorganismes du sol pour surmonter les limitations en éléments nutritifs. L'association bénéfique entre les légumineuses et les bactéries rhizobiennes implique le développement d'un nouvel organe spécialisé, le nodule racinaire, au sein duquel la bactérie est hébergée dans un environnement idéal pour fixer l'azote au bénéfice de la plante hôte. Suite à un dialogue moléculaire entre les deux partenaires, les rhizobia pénètrent dans la racine de l'hôte par le biais de compartiments intracellulaires nouvellement formés, appelés cordons d’infection (IT, pour Infection Thread), qui guident l’entrée des bactéries suivant une route prédéfinie par l’hôte végétal. Ce processus est contrôlé par des facteurs de transcription de la plante, qui régulent des étapes précises de cette entrée au niveau de l’épiderme et du cortex racinaire. De manière remarquable, les cellules du cortex associées à un poil infecté, sont activées en amont, en vue du futur passage de l’IT en croissance. Cette reprogrammation implique un remodelage cytoplasmique et une repolarisation majeure pour former un pont cytoplasmique, ou Pre-Infection thread (PIT) préparant l’entrée future du cordon d’infection. Bien que cruciale pour l’entrée microbienne, l’étude de cette reprogrammation est restée marginale, en partie à cause de la difficulté d’accéder à ces réponses, localisées seulement au niveau de quelques cellules au sein d’un site d’infection. Il a été suggéré que cette préparation implique des signaux calciques, mais les modalités d’articulation de cette signalisation avec les remodelages cytoplasmiques ne sont pas connues. L’équipe a mis en évidence des facteurs de transcription ERF (appelés ERN1 et ERN2) de M. truncatula contrôlant la formation des cordons d'infections dans l’épiderme mais aussi sa progression au sein des cellules du cortex, lieu de la reprogrammation cellulaire. De plus, le facteur ERN1 a été localisé dans ces cellules corticales en préparation pour l’infection, soulevant la question de son implication dans ce processus. Ainsi au cours de ma thèse, j’ai étudié les mécanismes cellulaires liés à la reprogrammation pour l’infection chez M. truncatula et la contribution des facteurs de transcription ERN1/2 dans ce processus. J'ai d'abord mis en place de nouveaux outils d'imagerie confocale in vivo permettant de suivre les différentes étapes de cette reprogrammation au niveau cellulaire. Au cours d’une partie technologique, j’ai pu développer de nouveaux outils fluorescents permettant (i) de suivre le remodelage cytoplasmique in vivo des cellules mais aussi (ii) les réponses calciques symbiotiques grâce à des senseurs GECO performants. La mise en place des sondes GECO a aussi impliqué la génération de nouvelles sondes calciques doubles qui nous ont permis de suivre la dynamique spatio-temporelle de la réponse calcique symbiotique au sein de deux compartiments cellulaires à la fois, et de démontrer l’initiation préférentielle de cette réponse dans le compartiment nucléaire. Dans un deuxième temps, l’étude ciblée de la reprogrammation cellulaire dans des contextes symbiotiques sauvage et mutants, nous a permis de définir le lien spatio-temporel entre les signaux calciques et le remodelage cytoplasmique pour la reprogrammation cellulaire liée à l’infection, et de démontrer l’importance des facteurs ERN dans ce processus. Cette étude a aussi révélé la participation potentielle d’une protéine de liaison au calcium, l’annexine MtAnn1, dont j’ai démontré par des études RNAi préliminaires l'importance pour la formation nodulaire. Enfin, dans une étude ciblée du rôle d’ERN1 en lien avec la signalisation calcique, j’ai exploité et démontré l’importance d’un résidu sérine, potentiellement phosphorylable par des kinases calcium-dépendantes, pour l’activité transcriptionelle et la fonction d’ERN1 lors de l'infection endosymbiotique. |
Plants have the ability to associate with microorganisms in the soil to overcome nutrient limitation. The beneficial symbiotic association between legumes and rhizobia bacteria leads to the development of a new specialized organ, the root nodule, within which the bacteria find the optimal environment for fixing nitrogen for their host plant. Following an initial molecular dialogue between the plant and the bacterial partner, rhizobia enter the host root via a newly formed intracellular compartment, known as the Infection Thread (IT), which guides the entry of the bacteria following a route predefined by the plant. This process is under the control of key plant transcription factors, which regulate specific steps of this entry in both the root epidermis and cortex. Remarkably, cortical cells underlying an infected epidermal site are activated in advance, in view of the future passage of the IT. This reprogramming involves major remodeling and cytoplasmic polarization to form a cytoplasmic bridge, or pre-infection thread (PIT) for the future passage of the IT. Although important for microbial entry, the study of this reprogramming has remained marginal, partly because of the difficulty to access this localized response, restricted to a few root cells. Recently, calcium signals have been implicated in this preparation, but how this signal articulates with cell remodeling is not known. The host team has identified ERF transcription factors (called ERN1 and ERN2) of M. truncatula controlling the formation of ITs, and their progression into sites of cellular reprogramming in the cortex. ERN1 has in addition been localized within the nucleus of these infection-primed cells, raising the question of its participation in this cellular reprogramming. My PhD work was focused on the study of this infection reprogramming in M. truncatula, with the objectives of defining (i) the underlying cellular mechanisms and the contribution of ERN1/2 transcription factors to this process. To this end, we first set up new confocal imaging tools for the in vivo follow up of the different stages of this reprogramming at the cellular level. As described in a technological-driven part, we were able to develop (i) new fluorescent tools for tracking in vivo the cytoplasmic remodeling of cells and (ii) efficient GECO sensors for monitoring the symbiotic calcium responses. The setting up of these sensors also involved the development of dual GECO sensor probes, which allowed us to monitor simultaneously symbiotic calcium responses in two adjacent cellular compartments. These analyses revealed the preferential initiation of symbiotic calcium oscillations within the nucleus, rather than in the cytoplasmic compartment. The subsequent analyses of the in vivo cellular reprogramming in both wild-type and mutant contexts of M. truncatula, allowed us to define the spatio-temporal interconnection between calcium signals and cytoplasmic remodeling during infection reprogramming, and demonstrate the importance of ERN factors in this process. This study also revealed the potential involvement of the calcium binding protein, annexin MtAnn1, which we demonstrated in a preliminary RNAi study to be important for nodule formation. Finally, in a parallel study, we have exploited and demonstrated the importance of a conserved ERN1 serine residue, which can be potentially phosphorylated by calcium-dependent kinases, for ERN1 transcriptional activity and symbiotic function. |