L’alternane-saccharase (ASR) de Leuconostoc citreum NRRL B-1355 est une α-transglucosylase de la famille 70 des glycoside-hydrolases (GH70). En particulier, les glucane-saccharases de cette famille utilisent le saccharose, un substrat abondant et peu coûteux, pour catalyser la formation d’homopolymères d’unité glucose de haute masse molaire, appelés α-glucanes, trouvant des applications dans les domaines de l’agroalimentaire ou de la santé par exemple. L’ASR est une glucane-saccharase originale de par sa capacité à produire un α-glucane particulier, l’alternane, dont la structure est composée de liaisons osidiques α-1,3 et α-1,6 alternées dans la chaîne principale. De plus, l’ASR synthétise une population bimodale d’alternane de haute ou faible masse molaire. Avec une température optimale de 45°C, l’ASR est aussi connue comme étant l’une des glucane-saccharases les plus stables qui existent jusqu’à présent. Cependant, en l’absence de données structurales, la plupart des déterminants de la spécificité de liaison, de la polymérisation et de la plus haute stabilité de l’ASR restent incompris. Pour remédier à cela, nous avons résolu la structure de cette enzyme à 2,8Å. Combinant une étude par mutagénèse dirigée à du docking moléculaire, nos résultats montrent l’importance de résidus définissant les sous-sites +2 et +2’ (Trp675 et Asp772), situés dans la prolongation des sous-sites -1 et +1. La spécificité de liaison serait contrôlée par le positionnement de l’accepteur dans l’un ou l’autre de ces sous-sites +2 ou +2’ pour former une liaison α-1,6 ou α-1,3 respectivement. Des complexes de l’ASR ont également été obtenus avec différents ligands et ont concentré notre attention sur un site situé sur la surface de l’enzyme, dans le domaine catalytique, auquel appartiennent deux résidus (Tyr717 et Gln700) impliqués dans la formation de l’alternane de haute masse molaire et dans l’ancrage de la chaîne d’alternane pendant la polymérisation. Ce site caractéristique de l’ASR pourrait jouer un rôle dans le passage du mode d’élongation distributif au processif. Enfin, une analyse poussée de la structure de l’ASR associée à la comparaison avec les structures de GH70 disponibles à ce jour a permis de constater la présence d’insertions dans des boucles du domaine A et C, qui pourraient être impliquées dans la stabilité de l’ASR. En particulier, le domaine C pourrait jouer un rôle dans la stabilité, celui de l’ASR possédant plus d’interactions que les autres. Pour évaluer cette hypothèse, des chimères ont été construites entre l’ASR et l’enzyme de branchement GBD-CD2, une enzyme moins stable que l’ASR, par échange de leur domaine C respectifs. Les premiers résultats indiquent que la chimère de GBD-CD2 est plus stable que l’enzyme sauvage, suggérant en effet une implication du domaine C dans la stabilité des enzymes de la famille GH70. En parallèle, des approches semi-rationnelles et de l’évolution dirigée ont été initiées afin de faire évoluer l’ASR vers une plus grande stabilité à la température et aux solvants. Les résultats obtenus au cours de cette thèse approfondissent la connaissance des déterminants structuraux de l’ASR gouvernant sa spécificité de liaison, le mécanisme de polymérisation et sa stabilité. Globalement, ces travaux ouvrent des nouvelles pistes d’investigation concernant l’étude des relations structure-fonction des glucane-saccharases et la conception de polymères de structure et propriétés physico-chimiques contrôlées. |
The alternansucrase (ASR) from Leuconostoc citreum NRRL B-1355 is an α-transglucosylase belonging to the family 70 of glycoside-hydrolases (GH70). In particular, the glucansucrases from this family use a cheap and abundant molecule, sucrose, to catalyze the formation of high molar mass (HMM) homopolymers of glucosyl units, called α-glucans, of interest for food, feed or health applications. ASR stands apart among these glucansucrases, being the only one to produce a particular α-glucan, the alternan, made of alternating α-1,6 and α-1,3 linkages in the main chain. Moreover, ASR produces a bimodal population of both HMM and lower molar mass (LMM) alternan. With a 45°C optimum temperature, ASR is also known as one of the most stable glucansucrases to date. However, in the absence of 3D structural data, most of the ASR determinants involved in linkage specificity, polymerization and higher stability remain unraveled. To get a deeper insight in ASR mechanism, we have solved the unliganded 3D structure of this enzyme at 2.8Å. Coupled to mutagenesis and molecular docking, our results shed the light on residues defining the +2 and +2’ subsites (Trp675 and Asp772), in the prolongation of ASR subsites -1 and +1. The positioning of acceptor in either +2 or +2’ subsite was submitted to control the linkage specificity in α-1,6 or in α-1,3 linkage formation respectively. Complexes of ASR with various sugar ligands were also obtained and highlighted a site on enzyme surface, in the catalytic domain, in which two amino acids (Tyr717 and Gln700) were shown to be involved in HMM alternan formation and in the alternan chain anchoring during polymerization. This site was characteristic of the ASR and plays a role in the switch from a distributive to a processive mode of elongation. Finally, a close inspection of the ASR structure combined to the comparison with the other GH70 3D structures available to date allowed the identification of amino acid insertion in loops of the domains A and C that could be involved in ASR stability. In particular, the ASR domain C was submitted to play a key role in stability, displaying higher level interactions than its counterparts. To evaluate this hypothesis, chimeras were constructed by domain C swapping between ASR and the branching sucrase GBD-CD2, a much less-stable enzyme. Preliminary results indicated the GBD-CD2 chimera to be more stable than the wild type, suggesting a role of the domain C in GH70 enzyme stability. In parallel, semi-rational and directed evolution of the ASR were initiated with the aim to obtain a variant with improved stability to temperature and organic solvents. Bringing all together, our results have deepened the knowledge of ASR structure, specificity, polymerization determinants and stability. Overall, it opens new paths of investigation for structure-function relationship studies of glucansucrases and for the conception of polymers with controlled structures and physicochemical properties. |