L’épithélium intestinal est un tissu complexe, hautement polarisé, organisé sous forme de cryptes et villosités. Les cellules souches intestinales résides au fond des cryptes où elles prolifèrent et se différentient tout en migrant vers le haut des villosités, ce qui permet le renouvèlement constant de l’épithélium tous les 3 à 5 jours. La maintenance de l’équilibre entre prolifération et différentiation est cruciale pour le développement et le maintien de l’intégrité tissulaire. Cet équilibre est supporté par le microenvironnement et l’organisation de l’épithélium qui permet la compartimentation et la protection des cellules souches. Des altérations de ces dernières sont à l’origine d’anomalie du développement ainsi que de la transformation tumorale. L’études des mécanismes impliqués dans la maintenance et dans la différentiation des cellules souches est donc essentielle pour mieux comprendre l’homéostasie tissulaire.
p57/Kip2 est un inhibiteur de cycline/CDK et un potentiel suppresseur de tumeur. p57 est également le gène le plus fréquemment muté ou réprimé dans le syndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS), caractérisé par des anomalies du développement et une prédisposition tumorale durant l’enfance. La génération d’un modèle de souris knock-in (p57CK-) dans lequel p57 ne lie plus les complexes cycline/CDK, a révélé que BWS résulte en partie de la perte de fonction indépendante des CDK de p57. Cette étude a également permis de révéler le rôle essentiel joué par p57 dans le développement intestinal, de manière indépendante des CDK.
Le premier objectif de ce projet de thèse a été d’étudier le rôle de p57 dans la maintenance des cellules souches intestinales. Deux types de cellules souches intestinales ont été décrites jusqu’à présent, les cellules souches prolifératives CBCs, responsable du renouvèlement constant de l’épithélium et les cellules souches +4 dites de réserve, mobilisées en cas de dommages afin de régénérer le tissu. J’ai pu mettre en évidence que p57 est impliqué dans la maintenance des cellules souches +4 de manière indépendante de l’inhibition des CDK. Les souris p57KO présentent une augmentation de la prolifération dans les cryptes due à une amplification des cellules progénitrices et de ces cellules souches +4, alors que les CBCs ne sont pas affectées. J’ai également étudié le mécanisme moléculaire par lequel p57 contrôle la prolifération des cellules de la crypte et identifié Ascl2, un facteur de transcription clé dans le maintien des cellules souches, comme nouveau partenaire de p57. Mes données montrent que p57 est capable d’inhiber l’activité transcriptionnelle d’Ascl2, via la formation d’un complexe co-répresseur avec HDAC7 et mSin3a. Ainsi ces travaux ont permis d’identifier une nouvelle fonction de p57 dans les cellules souches intestinales au cours du développement et pourrait expliquer le rôle de p57 dans la tumorigénèse intestinale.
Le deuxième objectif de mon projet de thèse a été de développer un nouveau modèle de culture pour l’études des cellules souches intestinales. En effet, à l’heure actuelle, les études in vitro sont limité à des modèles 2D ou des systèmes 3D de types organoïdes qui ne récapitulent pas complètement l’architecture 3D, le microenvironnement et la compartimentalisation présente au sein du tissu in vivo. Dans un premier temps, j’ai développé un nouvel hydrogel photopolymérisable compatible avec la culture de lignées cancéreuses colorectales. Ce matériau a ensuite été mis en forme par impression 3D haute résolution afin de fabriquer des supports de culture mimant l’architecture tissulaire l’intestin. Enfin, j’ai pu montrer que ces modèles 3D permettent la croissance des cellules colorectales Caco-2 pendant au moins trois semaines, et que la culture en trois dimensions favorise leur polarisation. Ces modèles 3D pourraient donc constituer une approche alternative aux systèmes de culture actuellement disponible afin d’étudier les mécanismes gouvernant l’homéostasie tissulaire.
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The small intestine is a complex tissue with a crypt/villus architecture and high tissue polarity. Intestinal stem cells are located at the crypt bottom where they proliferate and differentiate while they migrate upward to the top of villi, allowing the constant renewal of the entire intestinal epithelium every 3 to 5 days. Compartmentalization in the crypt plays a key role in stem cell protection and maintenance, and this is supported by the microenvironment and tissue organization. The balance between stem cell proliferation and differentiation is to maintain tissue integrity, and disruption of this balance leads to developmental anomalies and malignant transformation. Studying the mechanisms governing intestinal stem cells maintenance is therefore crucial to understand tissue homeostasis.
p57Kip2 is a cyclin/CDK inhibitor and a putative tumor suppressor. p57 is also the gene the most frequently mutated or silenced in Beckwith-Wiedemann syndrome (BWS), characterized by multiple developmental defects and tumor predisposition during childhood. Generation of knock-in mice expressing a mutant p57 (p57CK-) that cannot bind to cyclins and CDKs demonstrated that p57 exerts CDK independent functions during development and that BWS is not entirely caused by loss of CDK inhibition due to p57 inactivation.
The first aim of this project was to investigate the role of p57 in the maintenance of intestinal stem cells. Two population of stem cells have been described in the intestine: proliferative crypt base columnar cells (CBCs), responsible of the constant renewal of the epithelium, and quiescent +4 stem cells, activated during regeneration after tissue damage. I found that p57 is involved in maintaining the quiescence of the +4 reserve stem cells in a CDK independent manner. Indeed, p57KO mice exhibit an increased proliferation in the crypt caused by an amplification of +4 stem cells and of the progenitor population (transit amplifying cells), while CBCs are not affected by loss of p57. I also investigated the molecular mechanism by which p57 regulate these cells and found that p57 can bind Ascl2, a transcription factor critical for intestinal stem cell specification and maintenance. My result indicates that p57 can inhibit Ascl2 activity by participating in a transcriptional repressor complex with HDAC7 and mSin3a. This work has allowed the identification of a new function of p57 in intestinal stem cells during development and that could also be important during intestinal tumorigenesis.
The second aim of this project was to develop a new culture model to study intestinal stem cells. So far, most in vitro studies have been limited to 2D surfaces or 3D organoid cultures that do not fully recapitulate the tissue’s 3D architecture, microenvironment and cell compartmentalization existing in vivo. First, I developed a new photosensitive hydrogel amenable for culture of colorectal cancer cell lines that can be processed using high resolution 3D printing stereolithography to create scaffolds mimicking the architecture of intestinal epithelium. Finally, I showed that these 3D scaffolds support the cell growth of for 3 weeks, and that 3D culture promotes cell polarization. This model may constitute a complementary approach to organoid cultures to study intestinal homeostasis by allowing guided self-organization and controlled differentiation, as well as for in vitro drug screening and testing. |