Les thérapies anticancéreuses basées sur des principes physiques (radiofréquences, ultrasons, laser, électroporation…) ont considérablement augmenté lors de la dernière décennie. Leurs objectifs sont de détruire directement les cellules cancéreuses, de favoriser l’entrée ciblée de molécules thérapeutiques ou encore de stimuler le système immunitaire du patient afin d’éliminer la tumeur. Le plasma froid suscite l’intérêt dans le domaine de l’oncologie grâce à sa capacité à générer des espèces réactives oxygénées (ROS) et azotées (RNS) qui peuvent être génotoxique et cytotoxique pour les cellules cancéreuses. Deux approches d’utilisation du plasma sont étudiées : soit l’exposition directe de cellules au jet plasma, soit l’exposition indirecte via l’utilisation d’un Milieu Activé par Plasma (PAM). Le PAM étant plus facile à délivrer par injection dans la tumeur, c’est cette approche qui est choisie lors de ces travaux.
Le travail de thèse présenté consiste à étudier l’effet génotoxique et cytotoxique du PAM, obtenu après exposition du milieu au jet de plasma d’hélium, sur des tumeurs in vitro et in vivo. Pour les études in vitro, nous avons choisi d’utiliser un modèle 3D : le sphéroïde (MCTS – MultiCellular Tumor Spheroid). Ce modèle présente des caractéristiques proches du modèle in vivo grâce à son organisation en sphéroïde. Les MCTS présentent en effet des gradients de pénétration d’oxygène, de nutriments et de prolifération cellulaire.
La première partie de la thèse concerne l’identification et la quantification des espèces générées dans le PAM. Les méthodes d’analyses utilisées sont la résonance paramagnétique électronique, fluorimétrie, colorimétrique, chromatographie en phase liquide et spectrométrie de masse. Ces analyses ont mis en évidence que la toxicité du PAM était dûe à plusieurs facteurs : d’un côté la génération de ROS et RNS mais aussi à la dégradation des nutriments pour les cellules contenues dans le milieu via par exemple l’oxydation et nitrosylation des acides aminés.
La deuxième partie est dédiée à l’étude des effets du PAM sur les MCTS HCT-116 (cancer du côlon). En in vitro, le traitement PAM induit un détachement cellulaire en périphérie du sphéroïde 24h après traitement plasma. L'intérêt a donc été porté sur la cascade des mécanismes cellulaires mis en jeu et conduisant à la perte de volume du sphéroïde et à la mort des cellules en périphérie durant les premières 24h. L’étude de viabilité cellulaire a démontré une perte de viabilité de 50% après 2h de traitement. L'investigation des mécanismes de mort cellulaire a mis en évidence l’activation de mort cellulaire par apoptose et nécrose après 6h de traitement. Une étude pilote in vivo a permis de confirmer les effets génotoxique et cytotoxique du PAM.
La réponse au PAM d’une seconde lignée cellulaire (FaDu), cancer tête et cou, a été étudiée. En effet, bien qu'elle présente une réponse similaire aux HCT-116 à 24h, leur réponse à plus long terme diverge, avec une reprise de prolifération importante. Un traitement adapté par PAM a été mis en place pour pallier cette reprise de prolifération.
Tous ces résultats démontrent le potentiel des traitements PAM dans la recherche contre le cancer.
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Cancer therapies based on physical principles (radiofrequency, ultrasound, laser, electroporation...) have considerably increased in the last decade. Their objectives are to destroy cancer cells directly, to favor the targeted entry of therapeutic molecules or to stimulate the patient's immune system in order to eliminate the tumor. Cold plasma still arouses interest in the field of oncology through its ability to generate reactive oxygen species (ROS) and nitrogen (RNS) which can be genotoxic and cytotoxic for cancer cells. Two approaches to the use of plasma are studied: either direct exposure of cells to the plasma jet, or indirect exposure via the use of a Plasma Activated Medium (PAM). The PAM being easier to deliver by injection into the tumor, this approach was chosen in this work.
The work presented consists in studying the genotoxic and cytotoxic effect of PAM, obtained after exposure of the medium to the helium plasma jet, on tumors in vitro and in vivo. For in vitro studies, we chose to use a 3D model: the spheroid (MCTS - MultiCellular Tumor Spheroid). This model has characteristics similar to the in vivo model thanks to its spheroidal organization. The spheroids have indeed gradients of oxygen penetration, nutrients and cell proliferation.
The first part of the thesis concerns the identification and quantification of the species generated in PAM. The analytical methods used are paramagnetic electronic resonance, fluorimetry, colorimetry, liquid chromatography and mass spectrometry. These analyses revealed that the toxicity of PAM was due to several factors: on the one hand to the generation of ROS and RNS and on the other hand to the degradation of cell nutrients contained in the medium via, for example, the oxidation and nitrosylation of the amino acids.
The second part is dedicated to the study of the effects of PAM on HCT-116 (colon cancer) spheroids. In vitro, PAM treatment induces cell detachment at the periphery of the spheroid 24 hours after plasma treatment. An interest was therefore developed in the cascade of cellular mechanisms involved and leading to the loss of the spheroids volume and the death of peripheral cells during the first 24 hours. The cell viability study demonstrated a loss of viability of 50% after 2 hours of treatment. The investigation of cell death mechanisms revealed activation of cell death by apoptosis and necrosis after 6 hours of treatment. An in vivo pilot study confirmed the genotoxic and cytotoxic effects of PAM.
The response to PAM of a second cell line (FaDu), head and neck cancer, was studied. Indeed, although it has a similar response to HCT-116 at 24 hours, their longer-term response diverges, with a significant resumption of proliferation. Successive treatments with PAM have been put in place to overcome this proliferation.
All these results demonstrate the potential of PAM treatments in cancer research.
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