La Chimie Verte s’engage entre autres i) à mettre au point des procédés plus respectueux de l’environnement et viables économiquement, et ii) à essayer d’émanciper de la pétrochimie les filières de fabrication de produits, en promouvant l’utilisation de ressources renouvelables. Dans ce contexte, les enzymes représentent des alternatives aux catalyseurs chimiques toxiques et polluants et sont depuis longtemps appréciées pour leur extraordinaire efficacité et sélectivité pour les transformations biologiques et chimiques. Elles constituent notamment des outils de choix pour réaliser des réactions de synthèse et la panoplie de méthodes d’ingénierie de protéines disponibles à l’heure actuelle permet d’élargir encore plus le répertoire d'enzymes utilisables pour la synthèse spécifique et écoresponsable de molécules organiques à forte valeur ajoutée à partir de la biomasse végétale.
L’endoglycocéramidase II de Rhodoccoccus sp. M-777, une glycoside-hydrolase à rétention de configuration (rGH), a ainsi été la cible d’un travail de remodelage du site actif afin de réorienter son activité vers la synthèse de polyglucosides d’alkyles, de potentiels biosurfactants. Ainsi, grâce à une stratégie de design semi-rationnel, ciblant des résidus impliqués dans la reconnaissance de la molécule acceptrice, une transglycosylase efficace permettant d’atteindre des rendements de production de cellobioside d’alkyle de plus de 70% a été obtenue. La détermination des paramètres cinétiques de la réaction et la modélisation de la mutation découverte permettent de proposer des pistes sur les raisons de cette inversion du ratio hydrolyse/transglycosylation.
Dans un deuxième temps, une stratégie d'évolution dirigée multi-étapes a été appliquée à la féruloyle-estérase A d’Aspergillus niger pour la rendre plus résistante aux chocs thermiques et à la présence de solvants, deux propriétés requises pour pouvoir envisager d’utiliser cette enzyme pour des réactions de transfert dans des conditions industrielles thermodynamiquement favorables. Une méthodologie de criblage haut-débit, s’appuyant sur l’utilisation de substrats chromogéniques originaux, a été développée et a permis l’exploration efficace d’une diversité génétique de plus de 10 000 clones. Au terme de cette étude, un catalogue d’enzymes améliorées, soit pour leur thermostabilité, soit pour leur résistance aux solvants, soit pour les deux propriétés simultanément, a été obtenu, et donne accès à un ensemble de mutations, analysées au regard de leur effet sur l’activité de l’estérase.
Une dernière partie, prenant en compte l'analyse des résultats obtenus, propose des perspectives expérimentales pour aller plus loin dans la compréhension fondamentale des mécanismes moléculaire régissant la modulation du ratio T/H ainsi que la thermostabilité ou la résistance à la présence de solvant. L'accumulations de ces connaissances permettra de pouvoir plus efficacement rationaliser le design de biocatalyseur répondant aux attentes de la chimie verte.
Mots clés : Chimie verte, Biocatalyseur enzymatique, Evolution dirigée, Synthèse de molécules |
Green chemistry promotes, among other things i) the development of more environmentally friendly processes which need to remain economically viable, and (ii) the ending of polluting petrochemical industries by promoting the use of renewable resources. In this context, enzymes represent interesting alternatives to toxic and polluting chemical catalysts, and are appreciated for their extraordinary efficiency and selectivity in biological and chemical transformations. Notably, they constitute tools of choice for synthesis reactions, and the range of protein engineering methods available nowadays allows enlarging even more the repertoire of enzymes for the selective and eco-friendly synthesis of organic molecules with high added value from plant biomass.
Endoglycoceramidase II from Rhodococcus sp. M-777, a retaining glycoside hydrolase (rGH), was subjected to active-site remodelling in order to reorient its activity towards the synthesis of alkyl-polyglucosides, molecules with potential biosurfactant properties. Thus, thanks to a semi-rational design strategy, targeting residues involved in the recognition of the acceptor molecule, an efficient transglycosylase able to reach production yield of more than 70% of alkyl-cellobioside was obtained. A complete kinetic characterization associated to a modelling study of the identified improved mutant help to identify the determinants of this complete reversion of the transfer / hydrolysis ratio (T/H).
In a second part, a multi-step directed evolution strategy was applied to Aspergillus niger feruloyl-esterase A, in order to make it more resistant to heat shocks and to the presence of solvents, two prerequisites to use this enzyme for transfer reactions under thermodynamically favourable industrial conditions. A high-throughput screening methodology, relying on the use of original chromogenic substrates, was developed and allowed to efficiently explore a genetic diversity of more than 10,000 clones. This led to the establishment of a catalog of enzymes optimized either for their thermostability, or for their solvent resistance, or even for both properties at the same time, and to a list of mutations, possibly involved in resistance mechanisms.
Finally, considering all obtained results, in the last chapter, we propose experimental perspectives to go further in the fundamental understanding of the molecular mechanisms governing the modulation of the T/H ratio, or the temperature / solvent resistance of these enzymes. This will pave the way towards a more efficient way to rationally design biocatalysts meeting the expectations of green chemistry.
Key words: Green chemistry, Enzymatic biocatalyst, Directed evolution, Molecules synthesis |