Introduction :
Le cancer bronchique a bénéficié de deux grandes avancées thérapeutiques ces dernières années, avec le développement des thérapies ciblées et des immunothérapies. Les thérapies ciblées s’adressent à des patients dont la tumeur est porteuse d’une anomalie moléculaire activatrice qui doit être identifiée lors du diagnostic et des récidives. Le bénéfice des inhibiteurs de point de contrôle PD-L1/PD1 est supérieur en cas d’expression de PD-L1 en particulier en première ligne thérapeutique. Un génotypage large de la tumeur, ainsi que l’analyse de PD-L1 sont donc désormais réalisés en routine, habituellement sur le tissu. Les limites sont le caractère invasif des prélèvements, leur fréquente exiguïté, l’hétérogénéité tumorale dans le temps et dans l’espace.
La biopsie liquide, en particulier les cellules tumorales circulantes (CTC) et l’ADN tumoral circulant (ADNtc), peut permettre de s’affranchir de ces limites et de suivre l’évolution sub-clonale des tumeurs sous traitement.
Matériels et méthodes :
i) Profil moléculaire de tumeurs porteuses d’anomalies moléculaires activatrices et son évolution sous traitement par le biais de prélèvements plasmatiques itératifs.
Des prélèvements sanguins itératifs de patients porteurs d’une mutation de KRAS ou BRAF ont été collectés pour une comparaison de l’ADNtc et des CTC pour la détection de ces mutations par PCR digitale en émulsion (ddPCR).
Des échantillons plasmatiques de patients porteurs de différents génotypes (EGFR, mutations rares, réarrangements de ALK ou ROS1) ont ensuite été collectés et testés par séquençage à haut débit (next generation sequencing, NGS), à l’aide d’une technologie de séquençage d’amplicons couvrant des régions d’intérêt de 36 gènes.
ii) Recherche de biomarqueurs de réponse aux inhibiteurs de PD1
Nous avons suivi par ddPCR la réponse plasmatique de patients traités par anti-PD1 pour un adénocarcinome porteur d’une mutation de KRAS et présentant une pseudo-progression, et l’avons comparé à celle de vraie progression.
Les CTC de patients traités par anti-PD1 ont été isolées de manière itérative sous traitement et analysées pour l’expression de PD-L1 par immunofluorescence (IF).
Résultats :
i) 76 échantillons de 38 patients ont été étudiés. La sensibilité de la ddPCR était de 100% et 78% pour la détection des mutations de BRAF (n=6) et KRAS (n=32), respectivement. Les variations de la concentration de l’allèle muté dans le sang était corrélée à la réponse clinique (RECIST) dans 84% (BRAF) et 87.5% (KRAS) des cas. La sensibilité des CTC est plus basse (BRAF: 17%, KRAS: 34%).
Nous avons par la suite rapporté sur 168 échantillons de 46 patients, des sensibilité et spécificité (99.6%) élevées du NGS de l’ADNtc pour la détection de mutations ponctuelles communes (EGFR : 100%) et rares (67%), mais également pour la détection de réarrangements chromosomiques (ALK/ROS1 : 89%). Cette approche a permis de détecter plusieurs mois avant la progression clinique divers mécanismes de résistance (mutations, amplifications) aux inhibiteurs de tyrosine kinase (TKIs).
ii) La ddPCR a permis de distinguer rapidement les cas de pseudo-progression (diminution rapide et profonde de la concentration de l’allèle muté dés le premier mois de traitement) de cas de vraie progression (augmentation majeure).
162 filtres ISET collectés chez 96 patients traités par anti-PD1 ont permis l’analyse de l’expression de PD-L1 sur les CTC par IF. Il n’existe pas de concordance entre l’expression de PD-L1 par les CTC et la tumeur (r=0.03), probablement du fait de l’hétérogénéité tumorale. Un taux élevé de CTC est associé à un plus mauvais pronostique (p=0.008).
Conclusions:
L’ensemble de ces résultats démontre l’utilité de la biopsie liquide pour guider l’initiation et les modifications précoces de thérapies ciblées et immunothérapies.
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Background:
Metastatic lung cancer is one of the deadliest cancers but also benefits from the greatest therapeutic advances. Even if the prognosis remains poor, we have entered a hopeful era with the development of new genotype-directed drugs and of immune therapies, based on our better understanding of lung oncogenesis. Genotype-directed cancer agents target specific activated or overexpressed oncogenes, while outcomes with inhibitors of PD-L1/PD1 immune checkpoint depend on PD-L1 expression in the tumor. Complete genotyping and PD-L1 expression analysis on tumor tissue is thus now standard-of-care in advanced NSCLC. However, tissue analysis is invasive, time-consuming and only provides a snapshot of the molecular profile at a given time and location.
Liquid biopsy, in particular circulating tumor cells (CTCs) and cell free DNA (cfDNA), can non-invasively interrogate the tumor, taking into account tumor heterogeneity, and follow its sub-clonal evolution throughout treatment.
Methods
i) Assessment and monitoring of the molecular profile of tumors harboring specific genotypes using liquid biopsy.
Serial blood specimens from NSCLC patients with known KRAS and BRAF mutations were collected for comparative analysis of cfDNA and CTCs using droplet digital PCR (ddPCR).
Plasma samples from patients with advanced NSCLC and a known targetable genotype (EGFR, ALK/ROS1 rearrangements, other rare genotypes) were collected and analyzed, blinded to tumor genotype, using a tagged amplicon next-generation sequencing (NGS) of hotspots and coding regions in 36 genes.
ii) Liquid biopsy to predict and monitor response to ICI.
Kinetics of KRAS mutations in cfDNA from patients with pseudo-progression and true progression under PD1 inhibitors were compared using plasma ddPCR.
Serial CTCs specimens from patients were collected for PD-L1 expression analysis and monitoring throughout PD1 inhibitors therapy.
Results:
i) 76 specimens from 38 patients were studied. Sensitivity of plasma ddPCR was 100% and 78% for pretreatment detection of BRAF (n=6) and KRAS (n=32) mutations in cfDNA, respectively. cfDNA kinetics correlated with clinical response (RECIST) in 84% (BRAF) and 87.5% (KRAS) of cases. CTCs analyses showed lower sensitivities (BRAF: 17%, KRAS: 34%) and their kinetics were not correlated with response.
We then reported high sensitivity and specificity using tagged amplicon NGS for the detection of a full range of genotypes, including single-nucleotides variations (SNVs, EGFR: 100%, rare genotypes: 67%) and fusion genes (ALK/ROS1: 89%) in 168 cfDNA specimens from 46 advanced NSCLC patients. This alternative to hybrid-capture approaches has the ability for early detection of diverse and sometimes coexistent mechanisms of resistance to EGFR-TKIs, including acquired mutations or copy number variations (CNVs).
ii) Plasma ddPCR could quickly (1 month) distinguish pseudoprogression (n=2, rapid and dramatic plasma response) from true progression (significant increase of KRAS-mutated cfDNA).
162 serial CTCs specimens from 96 patients treated by PD1 inhibitors were collected. Due to tumor heterogeneity, PD-L1 expression on CTCs and tissue were not concordant (r=0.03). A high CTC load is a marker of poor prognosis (p=0.008). Pretreatment PD-L1(+) CTCs were detected more frequently in non-responding patients (p=0.04, PFS<6 months).
Conclusions:
All together, these results confirm the great capabilities of liquid biopsy in guiding initiation and early modifications of targeted therapies and immune therapies.
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