La cassure double-brin (CDB) constitue la lésion de l’ADN la plus toxique, puisqu’une seule CDB non réparée ou réparée de façon incorrecte peut conduire à la mort cellulaire. Cette toxicité est justement exploitée en clinique pour éradiquer les cellules tumorales. Ainsi, parmi l’arsenal des molécules utilisées en chimiothérapie, les poisons de topoisomérase I (TOPO1), tels que les dérivés de la camptothécine (CPT), sont capables d’induire dans l’ADN un type particulier de CDB à une seule extrémité ; celles-ci sont générées lors de la progression de la fourche de réplication qui entre en collision avec la TOPO1 bloquée sur l’ADN. Les cellules disposent de voies de réparation de l’ADN, essentielles à leur survie mais limitant d’autant l’effet toxique de la CPT. En particulier, les CDBs générées par la CPT sont réparées par recombinaison homologue (RH) puisque, en absence de seconde extrémité, elles ne peuvent être substrats de la jonction d’extrémités non homologues (JENH) qui, pour ligaturer l'ADN a besoin de deux extrémités. L’hétérodimère Ku, initiateur de la JENH est à la fois un détecteur majeur des CDBs de par son abondance nucléaire et sa forte affinité, et un puissant inhibiteur de la RH. Pour la compréhension des mécanismes déterminant le choix de la voie de réparation adaptée à chaque type de CBD, la régulation de la liaison de Ku aux CDBs à une extrémité est donc une question cruciale.
Mon premier projet de thèse a concerné la compréhension moléculaire du choix de la voie de réparation des CDBs à une extrémité. Par une technique de microscopie à haute résolution, j’ai d’abord montré que l’hétérodimère Ku et son partenaire la DNA-PKcs sont rapidement recrutés au niveau de ces dommages dans l’ADN de cellules humaines. J’ai ensuite démontré que grâce à la phosphorylation de CtIP par ATM et à l’action coordonnée des activités nucléases de MRE11 et CtIP, Ku est relargué des CDBs à une extrémité. Cependant, mes travaux suggèrent aussi l’existence d’une voie additionnelle pouvant relarguer Ku de plus 50% des CDBs à une extrémité. D’autre part, j’ai montré que la dissociation de la DNA-PKcs des CDBs à une extrémité dépend de sa phosphorylation par ATM au niveau du cluster ABCDE. A l’aide d’un mutant non phosphorylable de ce cluster, j’ai montré que le défaut de dissociation de la DNA-PKcs prévient le relargage de l’hétérodimère Ku dépendant de MRE11, et conduit à une JENH toxique sur les CDBs une extrémité.
Mon second projet de thèse a consisté à perturber les mécanismes contrôlant le choix de la voie de réparation dans le but d’augmenter l’efficacité et la sélectivité de la CPT. En effet, l’inhibition d’ATM induisant une sensibilisation dramatique des cellules en réplication à la CPT, il devrait être possible d’identifier d’autres sensibilisateurs à la CPT qui désorganiseraient la réparation des CDBs à une extrémité. J’ai ainsi mis au point un test de cytotoxicité capable de mettre en évidence, dans une lignée de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs), l’effet sensibilisateur connu des inhibiteurs d’ATM et de PARP-1 sur la CPT. Sur la base de cet essai, j’ai ensuite réalisé un criblage phénotypique de la banque du NIH composés de 725 molécules dont les propriétés pharmacologiques sont connues. J’ai ainsi identifié un antibiotique, la nitrofurantoïne capable de potentialiser l’effet de la CPT. Cependant, cette sensibilisation semble liée à la génération des espèces oxygénées réactives (ROS) par nitroréduction de la molécule. Bien que la toxicité de la nitrofurantoïne et de ses dérivés limitent leur utilisation en combinaison avec la CPT, l’exploitation de tels composés en tant que nouvel anti-cancéreux pourrait être envisagée.
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DNA double-strand break (DSB) is the most toxic DNA damage, because a single mis- or un-repaired DSB can lead to cell death. This toxicity is exploited in clinics to eradicate tumoral cells. So, among molecules currently used in chemotherapy, topoisomerase 1 (TOPO1) poisons such as camptothecin (CPT) derivatives, are able to generate a particular type of DSB bearing one single end (seDSBs); these lesions are created when a replication fork collides with the TOPO1 blocked on the DNA. However, cells have several DNA repair systems, which are essential for their survival but limit the toxic effects of CPT. In particular, seDSBs generated by CPT are repaired by homologous recombination (HR) because, devoid of a second end, they cannot be ligated by non-homologous end-joining (NHEJ). The Ku heterodimer, the initiator of the NHEJ is both a major detector of the DSBs due to its nuclear abundance and strong affinity, and a powerful HR inhibitor. Therefore, the regulation of Ku binding to one-ended DSB is a crucial question for the understanding of mechanisms determining the choice of the suitable DSB repair pathway.
My first thesis project aimed at deciphering the molecular mechanisms responsible for the DNA repair pathway choice at seDSBs. Firstly, I demonstrated that Ku and DNA-PKcs are rapidly recruited on seDSBs. Then, I showed that ATM-dependent phosphorylation of CtIP and the epistatic and coordinated actions of MRE11 and CtIP nuclease activities are required to limit the stable loading of Ku on seDSBs. My work also suggested the existence of an additional mechanism that contributes to prevent Ku accumulation at 50% of seDSBs. Moreover, I established that DNA-PKcs removal from seDSBs relies on ATM-dependent phosphorylation of the ABCDE cluster. Using a non-phosphorylable mutant of this cluster, I demonstrated that impaired DNA-PKcs removal prevents MRE11 from releasing Ku and activates toxic NHEJ on seDSBs.
My second thesis project was dedicated to target the repair pathway choice mechanisms in order to increase the selectivity and specificity of CPT. Indeed, since ATM inhibition increases drastically the death of replicative cells treated with CPT, we may identify others sensitizers able to disrupt the repair pathway choice. Firstly, I set up a cytotoxicity assay that reproduces on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) the sensitizing effect of ATM and PARP-1 inhibitors to CPT. On the basis of this assay, I performed a phenotypic screening of the NIH Clinical Collection consisting in 725 compounds whose pharmacological properties are well known. My screen led to identify the antibiotic nitrofurantoïn as a sensitizer of MEFs to CPT. However, this sensitization does not depend on Ku but rather seems to rely on Reactive Oxygen Species (ROS) generation by nitroreduction of the molecule. Despite the toxicity of nitrofurantoïn and its derivatives limiting their use in combination with CPT, the exploitation of such of compounds as new anti-cancerous agent may be interesting.
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