La production de molécules d’intérêt par voie microbienne peut être améliorée par différentes stratégies d’ingénierie. L’ingénierie enzymatique tient une place centrale dans l’obtention de souches de production économiquement viables. L’efficacité des voies de biosynthèse dépend en effet de l'efficacité de chaque enzyme de la voie. Les stratégies d’ingénierie enzymatique peuvent s’inspirer de solutions observées dans la nature. De plus, la technologie de la synthèse d’ADN permet aujourd’hui la création de nouvelles configurations d’enzymes à façon. La question est de savoir quelles configurations d’enzymes synthétiques sont efficaces et quelles sont les mises au point nécessaires pour confirmer leur efficacité. L’obtention de souches de production efficaces peut enfin s’appuyer sur l’utilisation d’outils issus de la biologie systémique.
La colocalisation des enzymes d’une voie de biosynthèse pourrait aider à la transformation rapide des intermédiaires d’une voie de biosynthèse et donc favoriser la production des molécules d’intérêt finaux. Des protéines multidomaines regroupant au sein d’une même protéine plusieurs activités enzymatiques sont décrites dans la nature. Ce travail de thèse s'est focalisé en partie sur la création de fusions synthétiques d’enzymes au sein de la voie de biosynthèse du beta carotène chez Saccharomyces cerevisiae. Différents types de fusions et d’organisations enzymatiques ont été testés sur les enzymes caroténogéniques. L’étude a mis en évidence une configuration de fusion efficace réduisant l’accumulation d’intermédiaires réactionnels en faveur de la production du beta carotène. La mesure précise des concentrations des caroténoïdes produits, couplée à des méthodes de quantification des enzymes ont permis de caractériser finement l’efficacité de chaque construction enzymatique. D’autres stratégies de colocalisation spatiale ont également été testées. Nous avons notamment utilisé les domaines d’interaction cohésine dockerine et la protéine oligomérique CcmK2 pour cela. Il a été montré que les enzymes caroténogéniques sont fonctionnelles dans ces conditions et ces différentes stratégies de colocalisation permettent aussi de modifier le flux de la voie de production en caroténoïde. Du au changement en concentration des intermédiaires de la voie, on observe un changement dans la nature du produit final. De manière intéressante, l’étude permet d’envisager qu’une régulation plus fine des niveaux d’activité des enzymes au sein des différentes stratégies de colocalisation pour choisir la nature du produit final. Les études sur des stratégies de colocalisation d’enzymes, notamment membranaires, sont peu décrites dans la littérature, ce travail de thèse a contribué à montrer des possibilités dans ce domaine. |
Microbial production of molecules of interest could be improved by several engineering strategies. Enzymatic engineering has a central role in the conception of efficient host because pathway’s efficiency depends in first place on the efficiency of enzymes. Enzymatic engineering can take inspiration from strategies observed in nature. Today, DNA synthesis technology allows the conception of potentially any kind of enzyme configuration. Challenges are today to know which synthetic enzymes conceptions might be efficient and what parameters need to be tested to characterize the best ones. Creating efficient microbial host can take advantage of the use of several tools from fields inside systemic biology.
Enzyme colocalisation inside metabolic pathway might improves the production of final molecule of interest by allowing rapid biotransformation of intermediates of the pathway. Multidomain proteins regrouping several enzymatic activities are described in the literature. This work focused on the creation of synthetic fusion of carotenogenic enzymes for the production of beta carotene in Saccharomyces cerevisiae. Different types of enzymatic fusions and configurations have been tested. The study allowed the creation of an efficient tripartite enzyme fusion which produces less intermediates and more beta carotene. Precise measurement of each carotenoid’s concentration coupled with quantification of enzymes allow the characterisation of the efficiency of each synthetic enzyme. Other strategies for enzyme spatial colocalisation have also been tested using domains of interaction like cohesine- dockerine or the oligomeric protein CcmK2. Carotenogenic enzymes are still functional using those strategies. Some of them have changed the metabolic flux of carotenoids inside the pathway. Concentration of intermediates which are substrates of last enzymatic steps changes and consequently the nature of the final product changes. Interestingly, a fine control of activity of enzyme might allow a fine control of the nature of the final carotenoid product. Other strategies for colocalisation of those enzymes could be envisaged. Colocalisation of membrane enzymes are less described in the literature compared with soluble enzymes, and this study gave some result in this direction. |