La paroi végétale est une structure complexe entourant la cellule végétale composée principalement de polysaccharides (cellulose, hémicellulose et pectine), de lignine et de protéines. La paroi végétale assure le maintien et impose la taille et la forme des cellules. Elle est également impliquée dans les échanges entre cellules et avec le milieu environnant. Les polysaccharides de cette paroi représentent la plus grande source de carbone renouvelable de la planète ce qui en fait des cibles de choix pour la production d’énergies vertes. La paroi végétale étant difficile à dégrader, son utilisation pour la production de biocarburants reste encore limitée. Or certains organismes vivants sont capables de dégrader efficacement cette biomasse. L’exploration de la diversité du monde vivant à la recherche de nouveaux biocatalyseurs efficaces a pris un essor considérable ces dernières années du fait, notamment, de l’émergence de la métagénomique.
Dans ce contexte et afin de découvrir de nouvelles enzymes impliquées dans la dégradation de la biomasse végétale, l’équipe « Catalyse et Ingénierie Moléculaire Enzymatiques » du LISBP a décidé d’explorer le métagénome d’organismes connus pour dégrader la biomasse végétale. Deux familles animales ont fait l’objet d’analyses métagénomiques, le termite et le ver de terre. Des banques métagénomiques de trois espèces différentes de termites ainsi qu’une banque métagénomique d’une espèce de ver de terre ont ainsi été générées.
Dans ces travaux de thèse deux des banques métagénomiques de termites, celle de Nasutitermes corniger et celle de Termes hispaniolae, ont fait l’objet d’une étude afin de comparer le potentiel hémicellulolytique de ces deux espèces. Après sélection de nombreux clones positifs sur substrats chromogéniques de chacune des deux banques, séquençage puis annotation taxonomique et fonctionnelle, un grand nombre d’enzymes et principalement des glycosides hydrolases, a pu être identifié. Les résultats obtenus ont montré que les tendances observées lors des cribles fonctionnels étaient maintenues. En effet il apparait que Nasutitermes corniger possède une majorité d’endoglycosidases alors que Termes hispaniolae possède majoritairement des exoglycosidases. Ainsi, les familles d’enzymes mises en évidence ont permis de corréler leurs activités hydrolytiques à l’alimentation de ces espèces. De plus, nous avons pu observer que le microbiote intestinal de chacun de ces termites diffère notablement. En effet, les deux termites ne possèdent pas les mêmes embranchements bactériens majoritaires et, le microbiote de Termes hispaniolae est plus diversifié que celui de Nasutitermes corniger.
D’autre part, l’annotation fonctionnelle de la banque métagénomique du ver de terre a révélé une enzyme annotée comme étant une glycoside hydrolase n’appartenant à aucune des 135 familles de glycosides hydrolases existantes à ce jour. Cette enzyme, appelée GH* semble proche des GH5 mais ne présente pas le résidu catalytique nucléophile parfaitement conservé dans cette famille de glycoside hydrolase. Une étude structurale et fonctionnelle de GH* a donc été menée. Nous avons montré que GH* est une endo-xylanase ayant une préférence pour les arabinoxylanes et les xylooligosaccharides de degré de polymérisation supérieur à 5. De plus, nous avons déterminé la structure cristallographique de GH* à 1,6Å de résolution. Cette structure tridimensionnelle a permis de confirmer la présence du résidu acide/base identifié par alignement de séquences et d’émettre une hypothèse sur l’identité du résidu nucléophile. Enfin des mutants de GH* pour ces deux résidus ont été obtenus et ont confirmé leur implication dans l’activité de l’enzyme. Nous avons ainsi pu progresser dans la compréhension des relations structure-fonction de cette protéine. |
Plant cell wall is a complex structure surrounding plant cells mainly composed by polysaccharides (cellulose, hemicellulose and pectin), lignin and proteins. The plant wall maintains and imposes the size and shape of cells. It is also important for exchanges between cells and extra cellular medium. The polysaccharides of this cell wall are the largest renewable carbon source on the earth, which makes them good targets to produce green energies. Because plant cell wall is difficult to degrade, its use for biofuels for is still limited. However some organisms are able to efficiently degrade this biomass. Exploring the diversity of the living word to discover new effective biocatalysts has grown considerably last years, because of the emergence of metagenomics.
In this context and to discover new enzymes involved in the degradation of plant biomass, the team « Catalyse et Ingénierie Moléculaire Enzymatiques » of LISBP decided to explore metagenome of organisms known to degrade plant biomass. Two animal families were chosen for metagenomics analysis, the termite and earthworm. Metagenomics banks of three different species of termite and one metagenomics bank of an earthworm were created.
In this thesis project, two of the three metagenomics banks of termites, the one from Nasutitermes corniger and the other one from Termes hispaniolae, were studied to compare the hemicellulolytic potential of these two species. After selection of many positive clones on chromogenic substrates of both banks, sequencing and taxonomic and functional annotations, a large number of enzymes and mainly glycoside hydrolases, could be identified. The results obtained shown that the trends observed during functional screens were maintained. Indeed, it appears that Nasutitermes corniger has a majority of endoglycosidases while Termes hispaniolae has mainly exoglycosidases. Thereby, families of enzymes highlighted allowed correlating their hydrolytic activities with the diet of these species. Furthermore, we observed that the intestinal microbiota of each termite is different. Indeed, both termites do not have the same majority bacterial phyla and the microbiota of Termes hispaniolae is more diverse than the one of Nasutitermes corniger.
On the other hand, functional annotation of the metagenomics bank of the earthworm revealed an enzyme annotated as a glycoside hydrolase no belonging to any of the 135 glycoside hydrolase existing families. This enzyme, named GH*, seems to be close to GH5 but does not shown the nucleophilic catalyst residue perfectly conserved in this glycoside hydrolase family. A functional and structural study of GH* was then done. We have shown that GH* is an endo-xylanase which prefers arabinoxylans and xylooligosaccharides having a polymerization degree greater than 5. In addition, we determined the crystal structure of GH* at 1.6Å resolution. This 3D structure has confirmed the presence of the acid/base residue identified by sequence alignment and allowed us to hypothesize about the identity of the nucleophilic residue. Finally, mutants of GH* for these two residues were obtained and confirmed their involvement in the activity of the enzyme. We were able to progress in the understanding of structure/function relationships of this protein. |