La maladie d’Alzheimer (MA) est la forme la plus fréquente de démence chez les personnes âgées. L’une de ses caractéristiques est la formation extracellulaire de plaques séniles dans le cerveau des malades, composées du peptide Amyloïde-β (Aβ) sous forme agrégée et d’ions métalliques tels que le cuivre. Le peptide Aβ forme un complexe avec les ions cuivre, capable de catalyser la formation d’espèces réactives de l’oxygène (ERO), en présence d’un réducteur tel que l’ascorbate. Ces espèces oxydantes sont délétères pour les molécules environnantes, ainsi que pour le peptide Aβ lui-même. Étant proche du site de production des ERO, Aβ est une cible privilégiée, notamment pour le radical hydroxyle HO•. L’objectif de ce travail a été d’étudier la réaction de production des ERO par le système Aβ/Cu/ascorbate, de caractériser les dommages oxydatifs subis par Aβ et d’évaluer les conséquences de l’oxydation de Aβ; sur la production des ERO, la coordination des ions métalliques et l’agrégation. Différentes techniques spectroscopiques ont été utilisées, notamment la spectrométrie de masse (MS), la spectroscopie de fluorescence, la résonance paramagnétique électronique (RPE) et l’absorption de rayons X (XANES).
Les sites d’oxydation du peptide Aβ ont été étudiés par spectrométrie de masse (MS et MS/MS). Grâce à l’utilisation des outils de la protéomique et de la spectrométrie de masse à haute-résolution (HRMS), les acides aminés oxydés du peptide Aβ ont été identifiés. Ainsi, Asp1, His13 et His14 sont les cibles privilégiées de l’attaque de HO•. Ce résultat était attendu puisque ces résidus sont impliqués dans la coordination du cuivre, par l’intermédiaire duquel les ERO sont directement générées.
L’impact de l’oxydation du peptide sur la coordination des ions métalliques Cu(II), Cu(I) et Zn(II), la production de ERO ainsi que sur l’agrégation du peptide a été étudié. Les résultats ont montré que l’oxydation du peptide induit un changement de coordination du Zn(II) ainsi que des deux états d’oxydation du cuivre, menant à une augmentation de la production de ERO. De plus, l’oxydation de Aβ a également un impact sur l’agrégation, ne privilégiant pas la formation de fibrilles.
Le mode de coordination du complexe Cu-Aβ lors de la production des ERO a été déduit de l’étude d’une série de peptides Aβ comprenant un ou plusieurs acides aminés mutés. L’hypothèse proposant que les acides aminés oxydés sont ceux liés au cuivre lors de la production des ERO (Asp1, His13 et 14) a été confortée, la mutation de Asp1 ou des deux His13 et 14 ayant un impact direct sur la production des ERO.
Enfin, les effets pro- et anti-oxydants de l’ascorbate ont été étudiés, montrant que, sur le système Cu-Aβ l’ascorbate n’exerce ses propriétés anti-oxydantes qu’à forte concentration pour les molécules environnantes, mais qu’il n’a aucun effet protecteur sur le peptide Aβ lui-même.
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Alzheimer’s Disease (AD) is the most frequent for of dementia in the elderly. A hallmark of AD is the extracellular formation of senile plaques in the brain of AD subjects, composed of the Amyloid-β peptide (Aβ) under aggregated form with metal ions such as copper ions. Aβ can form a complex with copper ions, able to catalyze reactive oxygen species (ROS) formation in the presence of a reducing agent such as ascorbate. These oxidative species can oxidize the surrounding molecules and the Aβ peptide itself. Being close to the production site of ROS, Aβ is the preferential target, especially for the hydroxyl radical HO•. The aim of this work was to study the ROS production by the Aβ/Cu/ascorbate system, to characterize the oxidation undergone by Aβ and to evaluate the consequences of Aβ oxidation on ROS production, metal ions coordination and aggregation. Several spectroscopic techniques have been used, in particular mass spectrometry (MS), fluorescence spectroscopy, electron paramagnetic resonance (EPR) and X-Ray absorption spectroscopy (XANES).
The oxidation sites of Aβ have been studied by mass spectrometry (MS and MS/MS). Thanks to the use of proteomic tools and high-resolution mass spectrometry (HRMS), the oxidized amino acid residues have been identified. Asp1, His 13 and His14 have been found to be the preferential targets for HO• on Aβ. This result was expected as these residues are involved in copper coordination, from which the ROS are generated.
The impact of Aβ oxidation on Cu(II), Cu(I) and Zn(II) on metal ions coordination, on ROS production and on Aβ aggregation has been studied. Results have shown that Aβ oxidation induces a change of coordination of Zn(II) as well as Cu(II) and Cu(I), leading to an increase of ROS production. Moreover, Aβ oxidation has also an impact on aggregation, as it does not favor fibrils formation.
The Cu-Aβ binding mode during ROS production has been deduced from the study of a series of mutated Aβ peptides. The hypothesis, in which the amino acid residues bound to Cu during the ROS production are the oxidized one (Asp1, His 13 and His14) has been corroborated by the results of this study, the mutation of Asp1 or the two His having an impact on ROS production.
Finally, the pro- and antioxidants effects of ascorbate have been investigated, showing that, on the Cu-Aβ system, ascorbate only has antioxidant properties at high concentration for surrounding molecules, but does not exhibit any protecting effect on Aβ itself. |