La formation des fruits charnus est un processus de développement impliquant trois stades principauxconnus comme étant la transition fleur/fruit ou nouaison, la croissance et enfin la maturation des fruits. Chacune de ces étapes correspond à une transition développementale associée à d'importants changements physiologiques et structurels. L'auxine est connue pour jouer,parmi d'autres hormones, un rôle important dans le déclenchement et la coordination des changements au cours du processus de nouaison et des phases de développement précoce du fruit. Au niveau transcriptionnel, la maise en place de la réponse à l'auxine nécessite l'intervention de facteurs de transcription appartenant à la famille des ARF (Axin Response Factor)connus pour réguler l'expression des gènes de réponse précoce à l'hormone en se liant aux Cis-éléments de type AuxRE (Auxin Response Element) possédant le motif conservé de réponse à l'auxine. Les ARF sont de ce fait des candidats forts pour faire partie du mécanisme moléculaire par lequel l'auxine intervientdans le processus de nouaison. Le projet de recherche réalisé au cours de la thèse a permis d'isoler et de caractériser au total 22 gènes Sl-ARF chez la tomate (Solanum lycopersicum), une plante modèle pour l'étude du développement et de la maturation des fruits charnus. Des profils d'expression distincts ont été révélés pour les gènes Sl-ARF selon les tissus et organes considérés, suggérant des fonctions spécifiques pour les membres de cette famille multigénique chez la tomate. De plus, il estmontré que certains gènes Sl-ARF peuvent être régulés à la fois par l'auxine et par l'éthylène, suggérant que ces derniers participent potentiellement au dialogue entre les voies de signalisation des deux hormones. L'expression transitoire a révélé la capacité des Sl-ARF d'agir au niveau transcriptionnel comme activateur ou répresseur dans la régulation de l'expression de gènes de réponse à l'auxine.L'étude des profils d'expression globale, réalisée par RNA-seqà l'échelle du génome entier, a révélé pour la première fois l'existence d'un niveau important de régulation par épissage alternatif des ARFs pendant la transition fleur-fruit chez la tomate. La localisation nucléaire des protéines SlARF8A / B a été déterminée par fusion avec legène rapporteur GFP puis expression dans un système "signle cell" dédié. L'analyse d'expression par RT- qPCR a révélé des caractéristiques distinctives entre ARF8A et ARF8B avec une augmentation notable des transcrits Sl-ARF8A suite à la pollinisation des fleurs. Le rôle physiologique du gène SlARF8A a été par la suite abordé par une approche de génétique inverse fournissant un nouvel éclairage sur les événements moléculaires qui sous-tendent la mise à fruit. La surexpression de SlARF8A / B dans la tomate engendre des phénotypes pléiotropiques touchant la croissance végétative (réduction de la taille des plantes, altération du développement racinaire et des tiges latérales) et l'appareil reproducteur avec la formation de fruits parthénocarpiques (absence de graines). L'analyse histologique a révélé une modification notable du placenta et des ovules chez les lignées desur-expression de SlARF8A. Les études par RNA-Seqont identifié plus de 6800 gènes différentiellement exprimés chez les sur expresseurs comparés auxlignées contrôles non transformées. Afin de mieux décortiquer les événements moléculaires impliqués dans le processus de nouaison des fruits dépendant de Sl-ARF8, des lignées exprimant des versions mutées mimant les variants d'épissage alternatif détectés auparavantont été générées. Ces mutants expriment des protéines ARF8 tronquées (exprimant les parties N et C-terminales) mais également des constructions exprimant des versions du gène ARF8 qui résistent à la dégradation par les microRNA. L'analyse phénotypique et moléculaire de ces lignées valide le rôle de miR167 dans la régulation de l'initiation du fruit. Par ailleurs, l'expression ectopique d'une version C-termainale du gène Sl-ARF8 résistant au miR167 donne également des fruits parthénocarpiques soutenant l'idée que la présence de la partie C-terminale comportant les domaines III et IV fonctionnels d'interaction avec les Aux/IAA est suffisante pour induire la parthénocarpie. Au total, l'étude réalisée au cours de la thèse fournit une description exhaustive de la familledes ARF chez la tomate et une caractérisation fonctionnelle du gène Sl-ARF8 qui souligne son rôle comme figure centrale du mécanisme de contrôle de la nouaison des fruits. |
The making of a fleshy fruit is a developmental process involving three mainstages known as fruitset, fruit growth and fruit ripening each corresponding to atransition step associated with major physiological and structural changes. Among other hormones, auxin is known to play a dynamic role in triggering and coordinatingthe changes associated with the process of fruit set and early fruit development. Auxin responses are mediated at the transcriptional level by Auxin Response Factors (ARFs) which regulate early auxin-responsive genes by specific binding to TGTCTC Auxin Response Elements (AuxREs). ARFs are therefore good candidates for being among the components of the molecular mechanism by which auxin mediates the fruit set. In the present study, a total of 22 Sl-ARFgenes have been isolated and characterized in tomato (Solanumlycopersicum), a model plant for the study of fleshy fruit development and ripening. Expression profiling revealed distinctive patterns for Sl-ARF genes indifferent tomato tissues. Hormone treatment indicated that Sl-ARFs can be regulated both by auxin and ethylene with SlARF2B, 5 and 9 likely to beinvolved in the cross-talk between the two hormones. Transient expression using a single cell system uncovered the ability of Sl-ARFs to act either as transcriptional activator or repressor in regulating the expression of auxin-responsive genes. Genome-wide expression profiling performed by deep RNA-Sequencing revealed for the first time the importance of the alternative splicing mode of regulation of ARF genes during tomato fruit set. The physiological significance of two closely related Sl-ARFs, SlARF8A and SlARF8B, was addressed in the present study via a reverse genetics approach providing new insight on themolecular events underlying tomato fruit set. Fusion to GFP reporter gene indicated that both SlARF8A/B proteins are nuclear localized. Expression analysis by RT-qPCR revealed some distinctive features between ARF8A and ARF8B with a notable increase in SlARF8A transcript upon flower pollination. Over-expression of SlARF8A/B in tomato resultedin pleiotropic phenotypes, including dwarf plants, altered root and lateral shoot development and parthenocarpic fruits (seedless). Histological analysis revealed alteredplacenta and ovules development in SlARF8A-OX flowers and RNA-Seq profiling identified over 6800 differentially expressed (DE) genes in SlARF8AOXflower buds compared to wild type control plants. To further investigate the Sl-ARF8A-dependent molecular events involved in fruit set, Sl-ARF8A mutant variants were generated mimickingvarious alternative splice forms of Sl-ARF8.These mutant variants include those encoding truncated proteins (N-terminal and C-terminal moieties) but also constructs giving rise to miR-resistant forms of ARF8 transcripts. The data support the idea that miR167-dependent regulation is involved in inducing the formation of seedless fruit. On the other hand, the ectopic expression of a C-terminal version of Sl-ARF8 that is Resistant to miR167 also resulted in parthenocarpic fruit, suggestingthat the presence of a functional domain III and IV required for interaction with Aux/IAA partners is sufficient to induce the formation of parthenocarpic fruit. Altogether, the present study provided a comphensive description of the tomato ARF gene family and a functional characterization of Sl-ARF8 defining this ARF member as a central figure of the control mechanism of the fruit set process. |