L’hydrogène gazeux est une source d’énergie particulièrement attractive. A l’heure actuelle, les systèmes de bio-production de dihydrogène sont peu développés mais pourraient permettre de s’affranchir de l’utilisation des énergies fossiles. Parmi ces systèmes la fermentation bactérienne, pourrait être utilisée. La bactérie Clostridium acetobutylicum est étudiée depuis de nombreuses années du fait de ses capacités naturelles à produire des solvants et du dihydrogène. Chez cette bactérie, la production de dihydrogène est catalysée par des hydrogénases, enzymes impliquées dans l’oxydation de la ferrédoxine réduite, qui permet la réduction des protons et la formation du gaz. Parmi les différentes classes d’hydrogénases, les hydrogénases à fer ([Fe-Fe] hydrogénases) sont très majoritairement impliquées dans la réduction des protons. Toutes les enzymes partagent un domaine protéique très conservé (le Domaine H), hébergeant le site catalytique inorganique (le Cluster H). L’enzyme CaHydA de C. acetobutylicum, possède également le Domaine F contenant en tous quatre centres fer-soufre dits accessoires. Au cours de ces travaux, l’implication des centres fer-soufre du Domaine F sur les capacités catalytiques de l’enzyme a été étudiée, ainsi que les mécanismes de transfert d’électrons entre l’enzyme et son partenaire physiologique d’oxydoréduction principal : la ferrédoxine 2[4Fe-4S].
Les conditions de purification de l’enzyme CaHydA ont tout d’abord été optimisées, permettant ainsi l’obtention d’enzymes hautement purifiées sans formation de formes dégradées. Un nouveau système d’expression hétérologue de la ferrédoxine 2[4Fe-4S] de C. acetobutylicum a été développé et a conduit à l’obtention de grande quantité de ferrédoxine dont la qualité a été validée de points de vue biophysique et biochimique. Différents variants ciblés de l’hydrogénase ont été créés, produits puis purifiés afin de les caractériser par une combinaison de méthodes biochimiques, électrochimiques, spectroscopiques et de modélisation moléculaire. Ceci a permis de mettre en évidence pour la première fois l’implication des centres fer-soufre accessoires du Domaine F dans les capacités catalytiques de l’enzyme. Enfin, il a été démontré que le centre [2Fe-2S] de surface FS2 de l’enzyme était le point d’entrée des électrons provenant de la ferrédoxine réduite. Par ailleurs, une approche ayant pour but de développer une souche ingénierée de C. acetobutylicum dont la croissance serait dépendante d’une hydrogénase mutée capable d’interagir dans les conditions physiologiques et donc utilisable pour le criblage in vivo d’hydrogénases variantes a été développée. Une telle souche a été construite mais sa caractérisation physiologique a montré qu’elle ne pouvait pas être finalement utilisée comme l’outil recherché ; en effet des mécanismes inattendus d’adaptation métabolique de la bactérie C. acetobutylicum ont été mis en évidence conduisant à l’obtention d’une souche capable de croitre sans aucune activité hydrogénase. |
Hydrogen is a promise full energy source. Systems for bioproduction of dihydrogen are poorly developed but could make it possible to avoid of the use of fossil fuels. The bacterium Clostridium acetobutylicum has been studied for many years due of its ability to produce solvents and dihydrogen. The hydrogenase catalyses the oxydation of reduced ferredoxin, leading to reduction of protons and dihydrogen formation. Among the three different classes of hydrogenases, the [Fe-Fe] Hydrogenases harbor a very conserved domain (H-Domain) containing the inorganic catalytic site (Cluster H). CaHydA from C. acetobutylicum possesses, in addition, the F-Domain containing four accessory iron-sulfur clusters. The involvement of accessory iron-sulfur cluster of F-Domain on the catalytic capacities of the enzyme has never been assessed. Moreover, which of the two surface iron-sulfur cluster of the F-Domain who interacts with the physiological redox partner ferredoxin is unknown.
CaHydA purification conditions have first been optimized, leading to the production of reproducible great amount of purified enzymes. Secondly, a new system for heterologous production of 2[4Fe-4S] ferredoxin in E. coli has been developed and led to the purification of a biochemically and biophysically validated ferredoxin. Different CaHydA mutants enzymes, modified in the Fe-S cluster composition of the F-Domain have been purified, and spectroscopically, biochemically and electrochemically characterized. These mutants enzymes, impaired in their catalytic activity both in solution and wired to an electrode, suggested, for the first time that the Fe-S clusters of the F-Domain have a long-range thermodynamic effect on the H-cluster and modulate enzyme’s functions. Moreover, it has been shown, and confirmed by molecular modelling, that the [2Fe-2S] surface cluster FS2 of the enzyme is the entry point for the electrons coming from the reduced ferredoxin.
Besides, an approach has been developed to engineer a C. acetobutylicum strain that can be used for the in vivo screening of mutated hydrogenases capable of interacting under physiological conditionsto sustain the growth of a C. acetobutylicum strain. This strain has been successfully obtain but could not be used as intended; indeed, its physiological and genetic characterization revealed an unexpected mechanism of metabolic adaptation of the bacterium C. acetobutylicum leading to the selection of a strain capable of growing without any hydrogenase activity, which was never described before. |