Les maladies auto-immunes touchent 5% de la population des pays occidentaux et représentent un problème majeur de santé publique. A l’heure actuelle, il n’y a pas de stratégie préventive, et les traitements disponibles sont encore peu efficaces. Il est maintenant bien établi qu’une sous-catégorie minoritaire de lymphocytes, les lymphocytes T régulateurs (Treg), joue un rôle primordial dans l'établissement de la tolérance au soi et le contrôle des réactions inflammatoires. Ces Treg sont caractérisés par l’expression du facteur de transcription Foxp3, lequel est essentiel pour leur développement ainsi que leur fonction. Dans les modèles expérimentaux ainsi qu’en pathologie humaine, un défaut de cette population de Treg favorise le développement d’affections auto-immunes, soulignant ainsi le potentiel thérapeutique de ces Treg. Afin de mieux exploiter ce potentiel, il est donc indispensable de caractériser les mécanismes moléculaires qui influencent le développement et les fonctions suppressives de ces cellules. La protéomique a énormément bénéficié des progrès récents réalisés sur les spectromètres de masse, et permet aujourd’hui de caractériser de façon extensive et quantitative des mélanges protéiques complexes, à partir d’échantillons disponibles en quantité très limitée. Mon projet de Thèse a donc consisté à caractériser à grande échelle le protéome des Treg via une approche protéomique de quantification sans marquage et de le comparer à celui des lymphocytes T conventionnels (Tconv) afin de définir une signature spécifique des Treg. Les populations Treg et Tconv ont été purifiées à partir de souris DEREG qui sont caractérisées par l’expression de la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) sous le contrôle direct du promoteur Foxp3. L’analyse protéomique globale de ces deux sous-populations a été réalisée par nanoLC-MS/MS sur un spectromètre de masse de type orbitrap à séquençage rapide. L’optimisation du fractionnement peptidique via des colonnes chromatographiques de 50 cm en amont de l’analyse a permis d’augmenter la profondeur d’analyse du protéome jusqu’à plus de 3000 protéines. Finalement, la comparaison du protéome des Treg versus celui des Tconv a permis de caractériser l’expression différentielle de nombreuses protéines déjà décrites dans la littérature comme marqueurs des Treg, telles que Foxp3 et CD25, validant ainsi l’approche analytique utilisée. En plus de ces protéines déjà connues, de nombreuses protéines ont été mises en évidence comme étant sur-exprimées ou sous-exprimées dans les Treg par rapport aux Tconv, dont la fonction n’a jamais été étudiée dans les Treg. Parmi ces protéines, nous avons identifié la protéine Themis1 comme particulièrement sous-exprimée dans les Treg. En utilisant un modèle de souris transgénique sur-exprimant Themis1, nous avons pu étudier le rôle de cette protéine dans le contrôle des fonctions suppressives des Treg à l’aide de tests de suppression in vitro et dans un modèle in vivo de colite. Nos résultats montrent que la surexpression de Themis1 dans les Treg augmente leur fonction suppressive, suggérant que Themis1 régule positivement la fonction des Treg. Cette étude apporte des éléments nouveaux sur la fonction de Themis1 comme régulateur positif des Treg, et suggère qu’elle pourrait être spécifiquement sous-exprimée dans ces cellules de façon à « freiner » la signalisation du récepteur T, et à éviter une fonction excessive des Treg qui pourrait avoir des effets délétères comme par exemple le développement de cancers. |
Autoimmune diseases affect 5% of the population of Western countries and represent a major public health problem. At present, there is no preventive strategy, and available treatments are still not very effective. It is now well established that a minor subset of lymphocytes, regulatory T cells (Treg) play a key role in establishing self-tolerance and controlling inflammatory reactions. These Treg are characterized by the expression of the transcription factor Foxp3, which is essential for their development and function. In experimental models and in human disease, a defect of this population of Treg promotes the development of autoimmune responses, highlighting the therapeutic potential of these Treg. To better exploit this potential, it is essential to characterize the molecular mechanisms that influence the development and suppressive function of these cells. Proteomics has highly benefited from recent advances on mass spectrometers, and today can be used to extensively and quantitatively characterize complex protein mixtures, starting from samples available in very limited quantities. My thesis project was therefore to perform a large-scale mass spectrometry study of the Treg proteome, and compare it to the proteome of conventionnal T cells (Tconv) using label-free quantitative methods, in order to identify new Treg markers and functionally important proteins. Treg and Tconv populations were purified from DEREG mice that are characterized by the expression of GFP (Green Fluorescent Protein) under the direct control of the Foxp3 promoter, allowing fluorescent detection and very efficient purification of Foxp3+ Treg cells by FACS sorting. The comprehensive proteomic analysis of Treg and Tconv subpopulations was performed by single-run nanoLC-MS/MS on a fast-sequencing Orbitrap mass spectrometer. The optimization of peptide fractionation on 50 cm chromatographic columns increased the depth of the proteomic analysis to over 3000 proteins per sample, and in total more than 4000 proteins could be identified from the analysis of 7 biological replicates. Finally, the proteomic comparison of Treg and Tconv led to the identification of many differentially expressed proteins that were previously described in the literature as markers of Treg, such as CD25 and Foxp3, validating our quantitative analytical workflow. In addition to these already known markers, many novel proteins were identified as being over- or under-expressed in Treg compared to Tconv, whose function has never been studied in Treg. Among them, we identified the Themis1 protein as particularly under-expressed in Treg. Using a transgenic mouse model overexpressing Themis1, we studied the role of this protein in the control of the suppressive functions of Treg, both in vitro through co-culture tests and in vivo in a mouse model of inflammatory bowel disease. Our results show that the overexpression of Themis1 in Treg increases their suppressive function, suggesting that Themis1 positively regulates the function of Treg. Themis1 is a recently identified protein, that was shown to take part in the T cell receptor (TCR) signaling machinery and to play an important role during T cell development in the thymus, but its precise mechanisms in the control of TCR signaling remains controversial. This study provides new information on the function of Themis1 as positive regulator of Treg, and suggests that it could be specifically under-expressed in these cells to tune down TCR signaling, in order to moderate the suppressive action of Treg, and permit the development of efficient immune response against pathogens and tumor. |