Les Glioblastomes (GBM) sont des tumeurs hautement létales en dépit du traitement conventionnel associant résection chirurgicale et chimio/radiothérapie. En effet, les GBM sont des tumeurs hétérogènes qui contiennent notamment une sous-population de cellules cancéreuses présentant des caractéristiques semblables aux cellules souches neurales (appelées GBM stem-like cells, GSC ou cellules initiatrices de GBM) et qui semble particulièrement impliquée dans la radio/chimiorésistance et la récidive de ces tumeurs. D'autre part, des études récentes ont montré que les cellules tumorales plus différenciées pourraient avoir la capacité de se dédifférencier et d'acquérir un phénotype plus proche des GSC en réponse à des conditions de stress environnemental comme l'hypoxie. Nous avons fait l'hypothèse que ce processus de dédifférenciation (aussi appelé plasticité) pourrait également avoir lieu en réponse aux radiations-ionisantes (RI) qui pourrait participer à la récidive rapide de ces tumeurs après radiothérapie.
Au cours de ma thèse j'ai travaillé sur plusieurs cultures primaires de cellules de GBM différenciées isolées à partir de résections de patients soumises à une dose de RI cliniquement relevante de 3Gy.
A long terme j'ai caractérisé les altérations phénotypiques des cellules de GBM en réponse aux RI en utilisant des techniques in vitro (qPCR, western blot, cytométrie en flux, test de formation de sphères en dilution limites) et in vivo (xénogreffes orthotopiques chez la souris NUDE).
J'ai démontré que l'exposition des cellules de GBM à une dose infra-toxique de RI potentialise la réacquisition à long terme de caractéristiques associées à l'état des GSC comme la capacité de génération de neurosphères primaires et secondaires, l'expression d'un panel de marqueurs souches et une augmentation de leur tumorigénicité. J'ai aussi identifié au cours de ce processus la surexpression de la protéine anti-apoptotique survivine dont l'inhibition spécifique par un inhibiteur pharmacologique utilisé en clinique (YM155) conduit au blocage de la plasticité radio-induite. L'ensemble de ces résultats montre que l'irradiation pourrait réguler la plasticité des cellules de GBM par l'intermédiaire d'une voie dépendante de la Survivine.
Au cours de la deuxième partie de mon travail de thèse, j'ai choisi d'analyser les changements métaboliques précoces ayant lieu au cours du processus de dédifférenciation radio-induit et qui pourraient favoriser la survie cellulaire et conduire à la mise en place de voies adaptatives pour favoriser l'acquisition d'un phénotype plus indifférencié. J'ai analysé différents paramètres métaboliques tels que la respiration mitochondriale, l'acidification extracellulaire en utilisant l'analyseur Seahorse ou encore la production d'ATP et de lactates. De cette manière j'ai pu mettre en évidence une reprogrammation métabolique déclenchée précocement après irradiation et identifier une enzyme responsable de ce processus. De plus, l'induction de cette protéine par l'irradiation serait est impliquée dans des changements du pH extracellulaire qui pourrait ainsi potentialiser le processus de dédifférenciation radio-induit.
A terme, le ciblage de ces mécanismes associés à la plasticité radio-induite pour inhiber ce processus adaptif aux RI et aussi une possible repopulation tumorale après traitement qui pourrait contribuer à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes afin d'améliorer la radiosensibilité de ces tumeurs cérébrales particulièrement agressives. |
Glioblastomas (GBM) are some highly lethal brain tumors despite a conventional treatment associating surgical resection and subsequent radio-chemotherapy. Amongst these heterogeneous tumors, a subpopulation of chemo- and radioresistant GBM stem-like cells appears to be involved in the systematic GBM recurrence. Moreover, recent studies showed that differentiated tumor cells may have the ability to dedifferentiate and acquire a stem-like phenotype, a phenomenon also called plasticity, in response to microenvironment stresses such as hypoxia. We hypothesized that GBM cells could be subjected to a similar dedifferentiation process after ionizing radiations (IR), then supporting the GBM rapid recurrence after radiotherapy.
During my thesis I worked on several differentiated GBM cell primo-culture isolated from patient resections and subjected them to a clinically relevant IR dose (3 Gy). I then characterized, after long term culture, the phenotypic and functional alterations displayed by these GBM cells using in vitro techniques (qPCR, western blot, flow cytometry, spheres formation assay in limiting dilution assays) and in vivo experiments (orthotopically-xenografted nude mice). I demonstrated that the exposure of differentiated GBM cells to a subtoxic IR dose potentiated the long-term reacquisition of stem-associated properties such as the ability to generate primary and secondary neurospheres, the expression of stemness markers and an increased tumorigenicity. I also identified during this process an up-regulation of the anti-apoptotic protein survivin and I showed that its down-regulation by YM-155, a selective survivin inhibitor used in anti-cancer clinical trials, led to the blockade of the IR-induced plasticity. Altogether, these results demonstrated that irradiation could regulate GBM cell plasticity via a survivin-dependent pathway.
During the second part of my thesis work, I chose to especially focus my research on the analysis of the early energetic metabolism alterations occurring during this dedifferentiation process under irradiation. Indeed, metabolic reprogramming in response to IR-induced stress could activate in these highly glycolytic cells several survival and adaptive pathways in order to promote the acquisition of a more undifferentiated state. I analyzed different metabolic parameters such as mitochondrial respiratory rate and extracellular acidification, using Seahorse analyzer, and performed measurements of ATP levels, lactate production and other metabolic markers. In this way, I highlighted the presence of a metabolic shift occurring quickly after IR and identified an enzymatic target responsible for this phenomenon. Moreover, this protein, which appears to be involved in the cellular environment change under irradiation, also seems to potentiate the long term dedifferentiation process induced by IR.
At term, targeting the mechanisms associated with IR-induced plasticity in order to inhibit the IR-induced adaptive processes and the subsequent tumor repopulation after treatment will likely contribute to develop some innovating pharmacological strategies for an improved radiosensitization of these aggressive brain cancers.
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