La séparation et la purification de biomolécules à partir de milieux bruts, végétaux ou biologiques, est un sujet vaste et complexe. De sa compréhension et de son développement dépendent des enjeux industriels, et notamment le complet développement des procédés biotechnologiques, les procédés de séparation, ou downstream processes, constituant environ 80 % des coûts totaux de ces procédés. Ce travail se veut une contribution à ces problématiques. Il a été motivé par des résultats obtenus au préalable dans le laboratoire qui montraient qu'il est possible de récupérer une protéine de très grande taille à partir d'un milieu réel végétal par l'application d'une seule opération chromatographique (Kerfai, 2011). Suite à ce résultat, des hypothèses ont été énoncées, auxquelles ce travail essaie de répondre : quel(s) mécanisme(s) peuvent expliquer ce résultat ? Existe-t-il une localisation spécifique pour la fixation de la molécule sur l'échangeur d'ions qui rend plus simple et efficace sa récupération lors de l'étape d'élution ?
Ainsi, notre objectif a été de progresser dans la connaissance des aspects fondamentaux de la chromatographie d'échange d'ions appliquée à la séparation des protéines à partir d'un milieu brut. Notamment, l'influence de la présence d'autres protéines dans le milieu a été analysée, et ce dans le cas particulier de protéines de poids moléculaire très différents, comme c'était le cas dans le travail précédemment cité.
Des approches variées, théoriques et expérimentales à différentes échelles sur des milieux réels ou synthétiques, ont été appliquées et parfois développées, pour essayer de répondre à ces questions. A l'échelle du procédé, une méthode statistique d'analyse des données (Analyse en Composants Principaux ou ACP) a été menée, dont l'exploitation reste délicate. A l'échelle du laboratoire, l'étude de l'équilibre et de la cinétique d'échange d'ions a été menée sur des solutions synthétiques de deux protéines : la sérum albumine bovine (BSA) (en tant que protéine de référence, couramment étudiée) et la ferritine (protéine de stockage du fer) de point isoélectrique proche de celui de la BSA mais de masse molaire plus élevée. Les résultats montrent que des modèles relativement classiques peuvent être appliqués, y compris pour les protéines de très grandes tailles, pour expliquer les aspects cinétiques de l'échange. Le couplage des flux de matière des protéines à l'intérieur des particules de l'échangeur est très probable, malgré des diffusivités très différentes. Interpréter les résultats d'équilibre reste bien plus ardu. La concentration en sel ou la présence de BSA n'ont que très peu d'effet sur la rétention de la ferritine à l'équilibre. En revanche, la présence de ferritine affecte très fortement la rétention de la BSA (pourtant plus favorable). Parmi les phénomènes suggérés dans la littérature, l'effet Vroman a été recherché, mais il n'a pas été constaté dans le système pour les conditions de travail utilisées. Les isothermes d'adsorption en conditions compétitives n'ont pas pu être simulées par les modèles habituels (comme l'isotherme multi-constituants de Langmuir), alors que celles des protéines seules sont tout à fait classiques. En outre, un blocage partiel des pores de la résine par la ferritine reste probable, empêchant la diffusion de la BSA. Afin de vérifier ce dernier point, une méthodologie a été développée afin d'observer à l'échelle microscopique les profils de concentration des éléments représentatifs du système (P, Fe, Cl…) dans les particules. Cette méthode qui se trouve à un stade très avancé de développement, n'a pas encore permis de conclure faute de sensibilité suffisante des sondes à disposition.
|
Bioseparations from crude media, vegetable or biological, is a large and complex subject. Future industrial issues depend on their understanding and development, namely for biotechnological processes as downstream processes represent up to 80 % of their total cost. This work hopes to contribute to these general questions. It is justified by previous results obtained in the laboratory showing that it is possible to recover a high molecular weight (HMW) protein from a complex vegetal juice in just one chromatographic operation. Hypotheses have been formulated, to which this work tries to answer: what mechanism could explain that behaviour? Is-there a specific location inside particles for the uptake of such a protein, facilitating the recovery during elution step?
Our objective has been to progress on the knowledge of fundamental questions concerning ion-exchange chromatography and their applications for proteins recovery from complex media. The effect of the other proteins in solution has been analysed, specifically in the situation where both proteins have a very different molecular weight, as in the previous cited work.
Theoretical and experimental approaches, at various scales, have been applied or developed on real or synthetic systems in order to answer some of these questions. At the process scale, a statistical method for data analysis (Principal Component Analysis or PCA) has been applied. The complete interpretation of its results remains very hard. At the laboratory scale, equilibrium and kinetics of ion exchange have been studied for synthetic solutions of two proteins: bovine serum albumin (BSA) (as reference protein widely studied), and ferritin (iron storage protein) having similar isoelectric point as BSA but with higher molecular weight. Classical models for ion-exchange kinetics can explain the experimental results, even for HMW proteins. Mass transfer fluxes seem to be coupled for both proteins, even if they have usually very different diffusivities. The interpretation of equilibrium results is much more difficult. Equilibrium uptake of ferritin is not, or lightly, influenced by salt concentration or BSA content. Nevertheless, the presence of ferritin in the medium affects strongly BSA equilibrium uptake (however more favourable). Among the phenomena suggested in the literature, the Vroman effect has been researched but it does not take place under the experimental conditions applied. Simulation of multi-component isotherms has not been possible by classical models (such as multi-component Langmuir isotherm), while protein isotherms in single solution are standard. Besides, a partial blockage of the resin pores by ferritin is possible, preventing BSA diffusion. Therefore, a methodology has been developed at the microscopic scale, with the aim to observe concentration profiles for representatives elements (P, Fe, Cl …) inside particles. The method, well developed, does not allow to conclude for the moment, because the probes used were not sensible enough.
|