Depuis son apparition il y a 25 ans, le microscope à force atomique (AFM) s'est révélé être un instrument de nano-caractérisation extrêmement puissant et polyvalent pour étudier les propriétés topographiques, chimiques, mécaniques des micro-organismes vivants dans leur milieu physiologique.
Néanmoins, un pré-requis impératif à ces caractérisations est d'immobiliser de manière efficace les objets biologiques sur des zones parfaitement définies d'une surface sans les dénaturer. Ceci reste actuellement un challenge qui stimule l'inventivité de plusieurs équipes dans le monde. Pour relever ce défi, nous avons développé deux approches d'assemblage dirigé complémentaires. La première est l'assemblage convectif/capillaire sur des substrats de Polydiméthylsiloxane (PDMS) microstructurés par micro-contact printing et biofonctionnalisés. La deuxième approche est basée sur la technique d'assemblage dirigé électrostatique appelée nanoxérographie. Elle consiste à fabriquer des motifs micrométriques monocouches de polyéthylèneimine (PEI), polymère cationique par greffage électrostatique sur des motifs chargés négativement dans une couche mince de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) par injection de charges par AFM. Ces motifs de PEI sont ensuite utilisés pour piéger localement les micro-organismes d'intérêt par interaction électrostatique. Nous avons montré que ces deux techniques d'assemblage dirigé offraient la possibilité d'immobiliser des micro-organismes vivants (levures Saccharomyces cerevisiae et bactéries Pseudomonas aeruginosa) individuels à des endroits bien définis sur une surface, sans les dénaturer, permettant leur caractérisation statistique topographique et mécanique par AFM en milieu liquide.
Un deuxième axe de ce travail de thèse a consisté à développer une nouvelle technique de fonctionnalisation de pointes AFM que nous avons brevetée. Cette technique permet de fonctionnaliser de manière simple et efficace les pointes AFM vendues dans le commerce par des dendrimères portant des groupements terminaux avec une fonction aldéhyde. Une fois modifiées, ces pointes AFM, appelées Dendritips, peuvent être greffées avec un grand nombre de composés différents (protéines, acide nucléique..) et ainsi permettre de multiples caractérisations chimiques et biologiques de micro-organismes vivants par AFM dans leur milieu physiologique.
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Since its beginning 25 years ago, the atomic force microscope (AFM) has been demonstrated to be a versatile and powerful instrument for nanoscopic characterization, particularly to study topographical, chemical, and mechanical properties of micro-organisms in their physiological environment.
However, these characterizations require that the biological objects to be studied are immobilized on defined areas of a substrate, without being denatured. This has been a challenge, which has stimulated innovative activity in several groups around the world. To overcome this challenge, we have developed two complementary directed assembly approaches. The first one concerns with convective/capillary assembly of the micro-organisms on PDMS substrates microstructured by micro-contact printing and subsequently biofunctionalized.
The second approach is based on the directed assembly through electrostatic forces, called as nanoxerography. The first step in this approach consists of creating patterns of polyethyleneimine (PEI), a cationic polymer, on polymethyl methacrylate (PMMA) thin films. This is achieved by creating a negatively charged pattern on PMMA films by the injection of charges by AFM. The PEI patterned substrates subsequently serve as positively charged templates that can electrostatically attract micro-organisms of interest. We have shown that these two assembly techniques offer the possibility of immobilizing different species of living micro-organisms (the yeast, Saccharomyces cerevisiae and the bacteria, Pseudomonas aeruginosa), individually on specified regions of the surface, without denaturing them. This allows for their statistical characterization by AFM in liquid phase, with respect to their topography and mechanical properties.
A second goal of the thesis work pertatins to the development of Dendritips: functionalized AFM tips, which has been patented. This consists of a simple method to functionalize the commercial AFM tips with aldehyde terminated dendrimers. Once modified, these tips can be grafted with a variety of biological compounds (proteins, nucleic acids, etc.) and used as probes for the chemical and biological characterization of living micro-organisms by AFM, in physiological media.
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