La transformation génétique naturelle est un mécanisme de transfert horizontal de gènes entièrement dirigé par la cellule réceptrice et très conservé au sein du règne bactérien. La transformation constitue un moteur important de l’évolution bactérienne et permet l’adaptation des bactéries à leur environnement en facilitant l’acquisition de nouveaux traits génétiques, tels que la résistance aux antibiotiques. Le mécanisme de transformation se décompose en trois grandes étapes : la capture d’un ADN double brin, nommé ADN transformant (ADNt), dans l’environnement extérieur via un pilus de transformation ; l’internalisation de l’ADNt sous forme simple brin dans le cytosol ; et l’intégration de cet ADNt au chromosome bactérien par recombinaison homologue. La transformation ne peut avoir lieu que si la bactérie est dans un état physiologique particulier et souvent transitoire, communément appelé la compétence. Les conditions et les mécanismes moléculaires responsables de l’induction de la compétence varient selon les espèces. A contrario, les acteurs centraux de la transformation sont globalement conservés parmi les espèces transformables, avec toutefois quelques variations interespèces. Nous étudions l’étape d’internalisation de l’ADNt dans l'organisme modèle et pathogène humain Streptococcus pneumoniae. Si la majorité des protéines nécessaires au transport de l’ADNt à travers la membrane bactérienne a été identifiée, la manière dont elles coordonnent leurs activités permettant cette étape de la transformation demeure mal caractérisée. Chez S. pneumoniae, cinq protéines jouent un rôle central dans l’internalisation de l’ADNt au cours de la transformation. Mes travaux de thèse se sont concentrés sur trois de ces protéines essentielles au processus de transformation : ComEC, une protéine transmembranaire supposée former un pore par lequel l’ADN simple brin pénètre dans le cytosol depuis le milieu extérieur ; ComFA, une translocase dépendante de l’ADN simple brin ; et ComFC, une protéine dont le rôle exact reste à déterminer. Au cours de mon doctorat, j’ai cherché à caractériser les interactions entre ComFA, ComFC et ComEC, ainsi que l’importance de ces interactions dans le processus de transformation. L’hydrophobicité, la taille et l’ancrage membranaire de ComEC compliquent sa caractérisation biochimique et structurale. Afin de contourner ces difficultés, je me suis appuyée sur un modèle de prédiction structurale fiable et robuste du complexe tripartite formé par les monomères de ComEC, ComFA et ComFC, en interaction avec l’ADNt. Ce modèle m’a permis de cibler des résidus d’acides aminés prédits comme impliqués dans les surfaces d’interaction protéique et donc susceptibles de jouer un rôle clé dans les interactions au sein de ce complexe. Des approches de génétique moléculaire in vivo ont ensuite montré que certains de ces résidus sont primordiaux pour la transformation. La robustesse du modèle ainsi que les effets cumulatifs des mutations testées suggèrent fortement que ComEC forme un canal transmembranaire monomérique qui s’associerait en complexe physique et fonctionnel avec ComFA et ComFC, assurant ainsi l’import de l’ADNt au travers de la membrane durant la transformation. La conservation de ces trois protéines ainsi que l’alignement des modèles du complexe tripartite chez plusieurs espèces suggèrent que ce mécanisme pourrait être conservé au sein des Firmicutes, un phylum principalement constitué de bactéries monodermes. J’ai par la suite prolongé l’étude sur le rôle de l’ATPase ComFA, conservée uniquement chez les Firmicutes, dans l’étape d’import de l’ADNt. En conclusion, ces travaux ont abouti à une meilleure compréhension du processus de transport de l’ADNt au travers de la membrane cytoplasmique durant la transformation, impliquant un complexe robuste, jusqu’alors inconnu, entre les effecteurs ComEC, ComFA et ComFC. Cela ouvre de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires du processus de transformation. |
Natural genetic transformation is a mechanism of horizontal gene transfer that is entirely controlled by the recipient cell and is well conserved in the bacterial kingdom. Transformation is a major driver of bacterial evolution, enabling bacteria to adapt to their environment by facilitating the acquisition of new genetic traits, such as antibiotic resistance. This process comprises three main stages: the capture of double-stranded DNA, known as transforming DNA (tDNA), from the external environment via a transformation pilus; the internalisation of the tDNA in single-stranded form into the cytosol; and the integration of this tDNA into the bacterial chromosome via homologous recombination. Transformation can only occur if the bacterium is in a specific and often transient physiological state, commonly known as competence. The conditions and molecular mechanisms responsible for inducing competence vary between species. Conversely, the key components involved in transformation are broadly conserved amongst transformable species, albeit with some inter-species variations. We are studying the tDNA internalisation step in the model organism and human pathogen Streptococcus pneumoniae. While the majority of the proteins required for the transport of tDNA across the bacterial membrane have been identified, how they coordinate their activities to enable this step of transformation remains poorly characterised. In S. pneumoniae, five proteins play a central role in the internalisation of tDNA during transformation. My PhD research focused on three of these proteins that are essential to this process: ComEC, a transmembrane protein thought to form a pore through which single-stranded DNA enters the cytosol from the external environment; ComFA, which is a single-stranded DNA-dependent translocase; and ComFC, the role of which remains to be determined. During my PhD, I sought to characterise the interactions between ComFA, ComFC and ComEC, as well as the significance of these interactions in the transformation process. Due to its hydrophobic nature, size and membrane association, biochemical and structural studies of ComEC are complex. To overcome these difficulties, I relied on a reliable and robust structural prediction model of the tripartite complex formed by the ComEC, ComFA and ComFC monomers, interacting with tDNA. This model allowed me to target amino acid residues predicted to be involved in protein interaction surfaces and therefore likely to play a key role in the interactions within this complex. In vivo molecular genetic approaches subsequently showed that some of these residues are crucial for transformation. The robustness of the model, combined with the cumulative effects of the mutations tested, strongly suggest that ComEC forms a monomeric transmembrane channel which physically interact to form a functional complex with ComFA and ComFC, thereby ensuring the import of tDNA across the membrane during transformation. The conservation of these three proteins, together with the alignment of tripartite complex models across several species, suggests that this mechanism may be conserved within the Firmicutes phylum, which consists mainly of monoderm bacteria. I then extended the study to investigate the role of the ComFA ATPase—conserved exclusively within the Firmicutes—in the tDNA import step. In conclusion, this work has improved our understanding of the process by which tDNA is transported across the cytoplasmic membrane during transformation. This process involves a robust, previously unknown complex comprising the effectors ComEC, ComFA and ComFC. This work sheds new light on the molecular mechanisms underlying the transformation process. |