Le carp edema virus (CEV) est présent en France depuis plus de 10 ans, touchant aussi bien les carpes communes que les carpes koï. Ce virus, bien qu’à l’origine de mortalités massives dans le monde entier, est encore mal connu. Des informations importantes pour établir une stratégie de lutte contre cet agent pathogène sont manquantes. Il faudrait en effet mieux caractériser la circulation du CEV, à la fois en le détectant de manière directe et indirecte dans les populations de carpes, mais aussi en réalisant un traçage moléculaire fin pour identifier les connexions entre compartiments. Ainsi, un premier axe de ce travail doctoral visait à développer des outils de surveillance directe et indirecte. Le second axe s’intéressait à l’amélioration des analyses génétiques afin d’améliorer la résolution du traçage moléculaire des populations de CEV.
Différentes matrices ont été échantillonnées lors d’importations de carpes koï afin de comparer leurs performances diagnostiques. En l’absence de gold standard, les estimations des performances ont été réalisées par modélisation en classes latentes. Ainsi, dans ce contexte précis, l’eau de transport s’est révélée être la matrice associée à la meilleure sensibilité avec un intervalle de crédibilité à 95% au-dessus de 0,9 lorsque l’ADN était extrait à partir de 1,5 mL.
La proportion de lots pour lesquels l’ADN du CEV a été détecté dans l’eau d’importation de carpe koï était élevée. Le génome viral a été détecté dans chacune des 6 importations échantillonnées et la proportion globale de lots positifs était de 73% (n=93 lots). A l’inverse, la présence de signes cliniques était faible (1 lot) et la mortalité non corrélée à la détection du génome viral. Ainsi, la présence de signes cliniques ou de mortalité ne concerne qu’une faible proportion des lots positifs.
Développer un test sérologique représente un défi dans le cas d’un virus non cultivable et de grande taille. Nous avons produit trois protéines du CEV dans un modèle recombinant procaryote. Les essais préliminaires réalisés avec seulement deux sérums ont montré une reconnaissance par le sérum présumé positif des trois protéines en Western blot conventionnel, alors que le sérum présumé négatif n’a révélé aucune bande. Ce résultat est un premier pas vers l’étude de la réponse humorale suite à une infection par le CEV nécessaire pour évaluer la pertinence d’un outil de dépistage sérologique.
Un génome quasi-complet d’un échantillon de génogroupe I a pu être assemblé. La proportion de reads du CEV étant très faible dans les échantillons disponibles, des stratégies de concentration ont dû être mises en place telles que l’ultracentrifugation et la déplétion de l’ADN de l’hôte par capture des îlots CpG méthylés.
Les analyses génomiques ont permis d’identifier 72 groupes d’orthologues conservés parmi les Poxviridae infectant des poissons et de comparer leur organisation dans ces différents génomes. Des analyses de conservation des séquences nucléotidiques entre des génomes de chacun des deux génogroupes du CEV ont été réalisées dans une vaste région centrale du génome. Ces résultats intermédiaires étaient nécessaires pour proposer de potentiels futurs marqueurs génétiques qui pourraient présenter une meilleure résolution phylogénétique que la cible couramment utilisée, P4a.
Les analyses menées sur un gène particulier, gp046, ont montré une diversité importante avec un gène qui pouvait être présent (allèle A), absent (allèle CΔ) ou remplacé par une petite séquence non codante (allèle BΔ). Cette diversité pouvait s’observer au sein d’un même échantillon avec la présence simultanée de deux allèles dans certains échantillons de carpes koï. Cette diversité intra-échantillon a aussi été observée avec le marqueur P4a, avec la détection de plusieurs séquences P4a à partir d’un extrait. Cette diversité intra-échantillon complique le traçage des populations de CEV avec des co-circulations possibles. |
Carp edema virus (CEV) has been present in France for more than 10 years, affecting both common carp and koi carp. Although this virus has caused massive mortality worldwide, it is still poorly understood. Important information needed to develop a strategy to combat this pathogen is lacking. It is essential to better characterize the circulation of CEV, both by detecting it directly and indirectly in carp populations and by conducting detailed molecular tracking to identify connections between compartments. Thus, the first focus of this doctoral work was to develop tools for direct and indirect surveillance. The second focus was on refining genetic analyses to improve the resolution of molecular tracking of CEV populations.
Various sample types were collected during koi carp imports to compare their diagnostic performance. In the absence of a gold standard, performance estimates were obtained using latent class modeling. Thus, in this specific context, shipping water proved to be the matrix associated with the highest sensitivity, with the lower bound of the 95% credible interval above 0.9 when DNA was extracted from 1.5 mL.
The proportion of consignments in which CEV DNA was detected in shipping water from imported koi carp was high. The viral genome was detected in each of the 6 sampled imports, and the overall proportion of positive consignments was 73% (n = 93 consignments). Conversely, clinical signs were observed in only one batch, and mortality was not correlated with detection of the viral genome. Thus, clinical signs or mortality were observed in only a small proportion of positive batches.
Developing a serological test poses a challenge in the case of a large, non-cultivable virus. We produced three CEV proteins in a prokaryotic recombinant system. Preliminary tests conducted with only two sera showed that the serum presumed to be positive recognized all three proteins in a conventional Western blot, whereas the serum presumed to be negative revealed no bands. This result is a first step toward studying the humoral response following CEV infection, which is necessary to evaluate the suitability of a serological screening tool.
A near-complete genome from a genogroup I sample was successfully assembled. Because the proportion of CEV reads was very low in the available samples, concentration strategies had to be implemented, such as ultracentrifugation and depletion of host DNA through the capture of methylated CpG islands.
Genomic analyses identified 72 groups of conserved orthologs among Poxviridae infecting fish and allowed for a comparison of their organization across these different genomes. Analyses of nucleotide sequence conservation between genomes from each of the two CEV genogroups were conducted across a large central region of the genome. These preliminary results were necessary to propose potential future genetic markers that could offer better phylogenetic resolution than the commonly used target, P4a.
Analyses of a specific gene, gp046, revealed significant diversity, with the gene either present (allele A), absent (allele CΔ), or replaced by a short noncoding sequence (allele BΔ). This diversity could be observed within a single sample, with the simultaneous presence of two alleles in some koi samples. This intra-sample diversity was also observed with the P4a marker, with the detection of multiple P4a sequences from a single extract. This intra-sample diversity complicates the tracking of CEV populations, with potential co-circulation. |