La transcription est un mécanisme essentiel au maintien de l'homéostasie cellulaire, permettant la production de protéines effectrices. La transcription est pervasive et produit de nombreux ARNs non codants instables, dont la majorité est rapidement dégradée par l'exosome ARN. La surveillance et la dégradation de ces ARNs sont essentiels pour maintenir l'intégrité du génome. L'exosome ARN et ses cofacteurs, notamment l'hélicase ARN Mtr4, favorisent la dégradation des ARNs en déroulant leur structure secondaire. Le rôle de Mtr4 dans la surveillance des ARNs est bien documenté, mais son rôle dans le maintien de l'intégrité génomique et l'homéostasie des R-loops reste encore mal compris. Les R-loops sont des structures physiologiques composées d'un hybride ADN:ARN et d'un brin d'ADN non hybridé, impliquées notamment dans la transcription. Bien que finement régulée, la formation d'une R-loop non physiologique peut bloquer la progression des fourches de réplication et de transcription, favorisant les cassures double brin de l'ADN (DSBs) et l'instabilité génomique. Des anomalies dans les voies de dégradation des ARNs favorisent l'accumulation d'hybrides ADN:ARN et l'instabilité génomique. Les processus de réparation restent imparfaits et peuvent induire des mutations, soulignant l'importance de prévenir les DSBs. Cependant, le rôle précis de Mtr4 dans ce processus de surveillance reste flou.
Dans cette étude, nous étudions le rôle de l'hélicase à ARN Mtr4, une protéine conservée identifiée comme cofacteur du complexe protéique insulateur dCTCF/Beaf-32, responsable de la délimitation des domaines d'association topologique (TAD). L'organisation de la chromatine en TAD est liée à la régulation des processus de réparation de l'ADN, et les frontières TAD constituent des sites génomiques sensibles aux DSBs. Nous avons notamment testé les rôles de Mtr4 dans la régulation des ARNs, le maintien de l'intégrité génomique, l'homéostasie des hybrides ADN:ARN et l'organisation 3D. À cette fin, nous avons utilisé des approches de séquençage du génome entier combinées à des analyses bioinformatiques pour tester son influence sur la régulation des niveaux d'ARN par RNA-seq, ses conséquences sur l'instabilité génomique par ChIP-seq et sur l'homéostasie des hybrides ADN:ARN par DRIP-seq. Nous avons également utilisé des ChIP-seq pour évaluer la liaison de cofacteur des insulateurs, notamment la cohésine, et surveiller les changements 3D par Hi-C.
Nous démontrons que Mtr4 joue un rôle crucial dans la régulation des ARN non codants, notamment les PROMPTs et les eRNAs, en accord avec des données récentes chez l'humain. La déplétion de Mtr4 induit également l'accumulation de la marque d'histone γH2AV/X associée aux DSBs, aux frontières des TAD, ainsi qu'au niveau des éléments régulateurs accumulant des ARNs non codants. Ces frontières sont également bordées par une accumulation d'hybrides ADN:ARN dépendants de la transcription, associée à une augmentation du recrutement de Rad51. Ces hybrides s'accumulent aux sites présentant un recrutement de cohésine altéré, suggérant d'éventuels défauts d'organisation 3D. Cette hypothèse est confirmée par nos données Hi-C, qui mettent en évidence des changements de compartiment allant de B vers A pour de nombreuses régions. Les locis affectés sont enrichis en sites d'accumulation d'ARN, en gènes surexprimés, en hybrides ADN:ARN et en signal γH2AV/X, ce qui met en évidence un mécanisme puissant par lequel de tels défauts pourraient réguler l'intégrité du génome et sa réorganisation 3D. Nous proposons donc que Mtr4 puisse agir comme un régulateur des ARNs ainsi que des hybrides ADN:ARN, influençant ainsi la liaison des cohésines, dont certaines sous-unités peuvent interagir avec l’ARN. Cette influence pourrait contribuer aux défauts d'organisation et d'intégrité du génome. Cette étude souligne l'importance des voies de dégradation de l'ARN dans le maintien de l'homéostasie nucléaire. |
Transcription is an essential mechanism for maintaining cellular homeostasis, allowing the production of effector proteins. Transcriptomic studies have revealed that transcription is pervasive and produces numerous unstable non-coding RNAs, the majority of which are rapidly degraded by RNA exosome after synthesis. Such RNA surveillance and degradation are crucial for maintaining genome integrity. RNA exosome and cofactors, notably the RNA helicase Mtr4, promote RNAs degradation after Mtr4 unwinds their secondary structure. The role of Mtr4 in RNA surveillance is well documented, but its role in maintaining genomic integrity and R-loop homeostasis remains incompletely understood. R-loops are physiological structures composed of a DNA:RNA hybrid and an unhybridized DNA strand, notably involved in transcription. Despite being finely regulated, formation of a non-physiological R-loop can block the progression of DNA replication and transcription forks, thereby defining a major source of DNA double stranded breaks (DSBs) and genomic instability. Previous studies have shown that defects in RNA degradation pathways promote the accumulation of DNA:RNA hybrids and genomic instability. Although multiple mechanisms exist to repair DSBs, these processes remain imperfect and can introduce mutations, emphasizing the importance of preventing DSBs. However, the precise role of Mtr4 in this surveillance process remains unclear.
Here, we investigated the role of the Mtr4 RNA helicase, a conserved protein identified as a cofactor of the dCTCF/Beaf-32 insulator protein complex, responsible for establishing the boundaries of topology association domains (TADs). 3D organisation of chromatin into TADs is closely linked to the regulation of DNA repair processes, while TAD borders constitute genomic sites particularly susceptible to DSBs. We notably tested Mtr4’s roles in regulating coding and non-coding RNAs, in maintaining genomic integrity, in DNA:RNA hybrids homeostasis, and in 3D organisation. To this end, we used genome-wide approaches with bioinformatic analyses, to test its influence in regulating RNA levels by RNA-seq, its consequences on genomic instability by ChIP-seq, and on DNA:RNA hybrids homeostasis by DRIP-seq. We also used ChIP-seq to assess the binding of insulators co-factor notably cohesine, and monitor changes in 3D by Hi-C.
We demonstrate that Mtr4 plays a crucial role in regulation of non-coding RNAs, particularly PROMPTs and eRNAs, consistent with recent data in human. Mtr4 depletion also triggers accumulation of the DSB-associated histone mark γH2AV/X at TAD borders, as well as at regulatory elements accumulating non-coding RNAs. TAD borders are also flanked by an accumulation of transcription-dependent DNA:RNA hybrids, which is associated with a specific increase in Rad51 recruitment. Of interest, such hybrids are accumulating at sites showing impaired cohesin recruitment, prompting us to test possible defects of 3D organization. This hypothesis is confirmed by our Hi-C data scoring genome-wide compartment shifts from B to A for numerous regions, specifically in Mtr4 depleted cells. Strikingly, the affected loci are actually enriched in sites accumulating RNAs, up-regulated genes, DNA:RNA hybrids and γH2AV/X signal, highlighting a potent mechanism by which such defects could regulate genome integrity and 3D reorganization. We thus propose that Mtr4 may acts as a regulator of RNAs and DNA:RNA hybrids, thereby influencing the binding of cohesins, some subunits of which can interact with RNA. This influence may contribute to defects in genome organization and genomic integrity. This study emphasizes the importance of a conserved RNA degradation pathways in maintaining nuclear homeostasis. |