Les mycoplasmes sont des bactéries étudiées notamment en tant que modèle de cellule minimale du fait de leurs petits génomes. En effet, Mycoplasma genitalium est le plus petit organisme capable de réplication autonome avec un génome d'une taille de 0.58 Mb pour 482 gènes codants. Les métaux de transition, tels que le fer et le zinc, sont essentiels à la vie et impliqués dans de nombreux processus cellulaires. À ce jour, peu de données sont disponibles sur le rôle des métaux chez les mycoplasmes, et les processus associés à l’homéostasie des métaux chez ces bactéries demeurent largement méconnus. L'objectif de ce projet de thèse est d’étudier les mécanismes d’acquisition et d’utilisation des métaux de transition chez les mycoplasmes pathogènes. Ma thèse a porté sur le modèle cellulaire Mycoplasma gallisepticum, un pathogène aviaire phylogénétiquement proche de mycoplasmes humains, et s’est divisée en 3 axes distincts. Le premier axe a consisté en une étude de protéomique comparative globale réalisée sur des extraits de cellules de M. gallisepticum cultivées en présence ou absence d’un chélateur de métaux sécrété par les cellules immunitaires de l’hôte lors de l’infection, dans le but d’observer des différences d’expression parmi les protéines impliquées dans l’homéostasie des métaux. Nous avons pu montrer, qu’en condition standard, M. gallisepticum séquestre le zinc, le fer et le cuivre. J’ai mis en place les protocoles de purification d’un chélateur d’origine aviaire, la calgranuline MRP126, de culture de M. gallisepticum dans les différentes conditions de traitement, et de préparation des échantillons pour l’analyse protéomique comparative. Les résultats obtenus montrent une couverture importante du protéome de M. gallisepticum avec 612 protéines uniques identifiées sur les 746 prédites, ce qui est supérieur aux protéomes décrits dans la littérature pour cet organisme. D’autre part, peu de différences d’expression ont été observées entre les conditions, suggérant une concentration de chélateur ou un temps de traitement inadapté. Le second axe du projet a concerné la caractérisation structurale de protéines responsables de la capture de solutés extracytoplasmiques au sein des transporteurs ABC (ATP-binding cassette). J’ai développé les protocoles de production recombinante chez Escherichia coli et de purification d’une de ces protéines. Des mesures biophysiques ont démontré une interaction entre la protéine purifiée et un métal, suggérant que cette protéine pourrait être impliquée dans l’import de métaux. Cette protéine a été cristallisée, mais la structure tridimensionnelle n’a pas pu être résolue en raison de l’absence de diffraction aux rayons X des différents cristaux obtenus. Le dernier axe de mon projet a porté sur la caractérisation structurale et fonctionnelle de deux métallohydrolases conservées et essentielles, la méthionine aminopeptidase (MetAP) et la peptide déformylase (PDF), dans l’objectif d’identifier la nature des cofacteurs associés et de démontrer leur utilisation. La MetAP produite et purifiée à partir d’E. coli s’est révélée active en présence de zinc et de manganèse. À l’inverse, la PDF recombinante n’est soluble et active qu’en présence de zinc. De plus, j’ai déterminé la structure de la PDF par cristallographie aux rayons X à 2.2 Å de résolution, validant le zinc comme cofacteur catalytique. Aussi la structure cristallographique a révélé un second site de liaison au zinc unique à cette PDF dont le rôle exact reste à déterminer. A travers une approche pluridisciplinaire, l’ensemble de ces résultats apporte de nouvelles informations et contribue à une meilleure compréhension de l’utilisation des métaux de transition chez les mycoplasmes, révélant notamment une préférence de M. gallisepticum pour le zinc. Au-delà des avancées dans chacun des trois axes de recherche, ce projet ouvre des perspectives pour l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques visant à lutter contre les mycoplasmes pathogènes. |
Mycoplasmas are bacteria studied notably as a model of the minimal cell due to their small genomes. Indeed, Mycoplasma genitalium is the smallest organism capable of autonomous replication, with a genome size of 0.58 Mb containing 482 protein-coding genes. Transition metals, such as iron and zinc, are essential for life and are involved in numerous cellular processes. To date, only few data are available on the role of metals in mycoplasmas, and the processes involved in metal homeostasis in these bacteria remain largely unknown. The aim of this PhD project is to decipher transition metal acquisition and utilisation in pathogenic mycoplasmas. My thesis focused on the Mycoplasma gallisepticum cell model, an avian pathogen phylogenetically closely related to human mycoplasmas, and was divided into three distinct axes. The first axis consisted of a comprehensive comparative proteomics study of M. gallisepticum cells cultured in the presence or absence of a metal chelator secreted by the host’s immune cells during infection, with the aim of observing differences in expression amongst the proteins involved in metal homeostasis. We were first able to demonstrate that, under standard conditions, M. gallisepticum sequesters zinc, iron and copper. Then, I established protocols for the purification of an avian chelator, calgranulin MRP126, for the cultivation of M. gallisepticum under various treatment conditions, and for the preparation of samples for comparative proteomic analyses. Our results show extensive coverage of the M. gallisepticum proteome, with 612 unique proteins identified out of the 746 predicted, which is higher than the proteomes described so far in the literature for this organism. However, only few differences in expression were observed between both conditions, suggesting that the chelator concentration or treatment time was not appropriate. The second axis of the project was the structural characterisation of proteins responsible for the uptake of extracellular solutes via ATP-binding cassette (ABC) transporters. I developed various protocols for the recombinant production of one of these proteins in Escherichia coli and for its purification. Biophysical measurements demonstrated an interaction between the purified recombinant protein and a metal, suggesting that this protein may be involved in the import of metals. This protein was also crystallised, but its three-dimensional structure could not be determined due to the absence of X-ray diffraction from the obtained crystals. The last axis of my project focused on the structural and functional characterisation of two conserved and essential metallohydrolases, the methionine aminopeptidase (MetAP) and the peptide deformylase (PDF), with the aim of identifying the nature of the associated cofactors and demonstrating their use. MetAP produced and purified from E. coli was found to be active in the presence of zinc and manganese. In contrast, recombinant PDF is soluble and active only in the presence of zinc. Furthermore, I determined the structure of PDF by X-ray crystallography at a resolution of 2.2 Å, confirming zinc as the catalytic cofactor. The crystallographic structure also revealed a second zinc-binding site unique to this PDF, the exact role of which remains to be determined. Taken together, these results indicate, in particular, that M. gallisepticum has a preference for zinc. Through a multidisciplinary approach, these findings collectively provide new insights and contribute to a better understanding of the use of transition metals in mycoplasmas, revealing, in particular, a preference for zinc in M. gallisepticum. In addition to the advances in each of the three areas of research, this project opens up new avenues for the identification of novel therapeutic targets aimed at combating pathogenic mycoplasmas. |