Les infections pulmonaires chroniques chez les patients atteints de mucoviscidose (MCV), sont particulièrement sévères et majoritairement causées par Pseudomonas aeruginosa (Pa), pathogène opportuniste majeur, souvent retrouvé en co-infection avec Mycobacterium abscessus (Mabs), une mycobactérie non-tuberculeuse associée à un déclin sévère de la fonction respiratoire.
La persistance de ces deux pathogènes dans les voies respiratoires et leur tolérance accrue aux antibiotiques sont fortement liées à leur capacité à former des biofilms, soulevant la question de leurs interactions au sein de biofilms polymicrobiens. Par ailleurs, les mécanismes de communication intercellulaire (Quorum Sensing) régulant les comportements collectifs chez les mycobactéries restent encore largement méconnus.
Cette thèse vise à développer un modèle in vitro de biofilm mixte mimant le microenvironnement pulmonaire de la mucoviscidose, à caractériser les interactions entre Mabs et Pa, et à explorer les mécanismes de Quorum Sensing chez Mabs afin d’identifier de potentielles cibles pour des stratégies antibiofilm.
Le premier axe a consisté à établir un modèle de co-culture entre P. aeruginosa et les morphotypes rugueux (R) et lisse (S) de M. abscessus. Pour cela, plusieurs conditions de culture ont été étudiées, notamment avec l'utilisation du milieu SCFM, mimant les conditions physicochimiques des poumons MCV. La combinaison d’approches microbiologiques et d'imagerie par microscopie confocale a permis de caractériser l’architecture des biofilms et l’influence du morphotype de M. abscessus sur leur développement. Les interactions entre les deux espèces, dépendantes des conditions de culture et du morphotype bactérien, ont induit des effets contrastés sur leur susceptibilité vis-àvis de deux antibiotiques utilisés en clinique. La co-culture réduit spécifiquement la tolérance de M. abscessus R à l'amikacine, tandis que la présence des deux morphotypes de M. abscessus diminue celle de P. aeruginosa à la tobramycine. Ces résultats indiquent que la réponse aux traitements au sein des biofilms mixtes est modulée de manière différentielle selon l'espèce, la molécule et le morphotype impliqués.
Dans le second axe, une approche bioinformatique combinant analyse d’homologie de séquence et homologie structurale a été mise en œuvre afin d’identifier des régulateurs, connus ou encore inexplorés, potentiellement impliqués dans le Quorum Sensing des mycobactéries. Nous avons ensuite développé une stratégie de CRISPRi afin d'étudier fonctionnellement les protéines candidates identifiées par l'étude in silico. Les premiers résultats suggèrent une implication potentielle de ces régulateurs dans la formation du biofilm mycobactérien.
Dans l'ensemble, ces travaux apportent de nouvelles connaissances sur la dynamique des biofilms mixtes Pa-Mabs et ouvrent la voie à l’identification de régulateurs du QS chez M. abscessus comme nouvelles cibles prometteuses pour le développement de stratégies innovantes contre les infections chroniques associées à la mucoviscidose. |
Chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF) are particularly severe and are mainly caused by Pseudomonas aeruginosa (Pa), a major opportunistic pathogen, often found in co-infection with Mycobacterium abscessus (Mabs), a non-tuberculous mycobacterium associated with severe decline in respiratory function.
The persistence of these two pathogens in the airways and their increased tolerance to antibiotics are strongly linked to their ability to form biofilms, raising the question of their interactions within polymicrobial biofilms. Furthermore, the mechanisms of intercellular communication (Quorum Sensing) regulating collective behaviors in mycobacteria remain largely unknown.
This thesis aims to develop an in vitro mixed biofilm model mimicking the pulmonary microenvironment of cystic fibrosis, to characterize the interactions between Mabs and Pa, and to explore Quorum Sensing mechanisms in Mabs in order to identify potential targets for antibiofilm strategies.
The first axis consisted of establishing a co-culture model between P. aeruginosa and the rough (R) and smooth (S) morphotypes of M. abscessus. To this end, several culture conditions were studied, notably using SCFM medium, which mimics the physicochemical conditions of CF lungs. The combination of microbiological approaches and confocal microscopy imaging made it possible to characterize the architecture of the biofilms and the influence of the M. abscessus morphotype on their development. The interactions between the two species, dependent on culture conditions and bacterial morphotype, induced contrasting effects on their susceptibility to two antibiotics used in clinical practice. Co-culture specifically reduced the tolerance of M. abscessus R to amikacin, whereas the presence of both M. abscessus morphotypes decreased that of P. aeruginosa tobramycin. These results indicate that the response to treatments within mixed biofilms is differentially modulated according to the species, molecule, and morphotype involved.
In the second axis, a bioinformatics approach combining sequence homology analysis and structural homology was implemented in order to identify regulators, either known or still unexplored, potentially involved in Quorum Sensing in mycobacteria. We then developed a CRISPRi strategy to functionally study the candidate proteins identified through the in silico study. The first results suggest a potential involvement of these regulators in mycobacterial biofilm formation.
Overall, this work provides new insights into the dynamics of Pa-Mabs mixed biofilms and paves the way for the identification of QS regulators in M. abscessus as promising new targets for the development of innovative strategies against chronic infections associated with cystic fibrosis. |