Les Leucémies Aiguës Myéloïdes (LAM) sont des hémopathies malignes caractérisées par la prolifération incontrôlée et l’accumulation de cellules leucémiques immatures, appelées blastes, dans la moelle osseuse et le sang des patients. Elles représentent un défi thérapeutique majeur en raison de leur forte hétérogénéité génétique et de leur plasticité cellulaire, qui favorisent l’émergence ou la sélection de clones résistants aux traitements, conduisant à un taux élevé de rechutes et à un pronostic souvent défavorable.
Si l’autophagie est reconnue comme un mécanisme favorisant la survie tumorale, ses fonctions non canoniques, notamment dans la régulation de la signalisation cellulaire et de la prolifération, restent encore mal comprises.
Afin de mieux comprendre son rôle dans les cellules leucémiques, nous avons ciblé ATG5, une protéine essentielle à l’autophagie, par interférence ARN (shRNA-ATG5) dans la lignée de LAM MOLM14. Cette inhibition diminue le nombre de cellules au cours du temps sans induire de mortalité significative. Nous avons ensuite comparé le protéome de cellules compétentes (sh-CTL) avec celui de cellules déficientes en autophagie (sh-ATG5) par spectrométrie de masse (LC-MS/MS). L’inhibition de ce processus altère significativement le protéome global, notamment l’expression de protéines impliquées dans le cycle cellulaire et la réplication de l’ADN. En accord avec ces observations, l’analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux montre une diminution significative du pourcentage de cellules sh-ATG5 en phase S. Ce phénotype a également été confirmé ex vivo sur des cellules issues de six patients atteints de LAM.
Pour identifier les protéines régulées par l’autophagie et susceptibles de participer au contrôle du cycle cellulaire, nous avons développé une méthode de purification des autophagosomes et analysé leur contenu protéique par LC-MS/MS. Le croisement de ces données avec celles obtenues sur des cellules entières a permis d’identifier la Lamine A/C, une protéine essentielle à l’architecture et aux fonctions du noyau. Sa présence au sein des autophagosomes, ainsi que son accumulation dans les cellules déficientes pour l’autophagie, ont été confirmées par western blot. Ces résultats suggèrent que l’autophagie favorise la progression du cycle cellulaire des cellules de LAM en régulant la demi-vie de la Lamine A/C. En maintenant l’intégrité nucléaire, l’autophagie pourrait ainsi contribuer à la capacité proliférative accrue des blastes leucémiques.
En parallèle, nous avons exploré le rôle de l’autophagie dans la régulation de la signalisation dépendante du récepteur FLT3-ITD. Des analyses par microscopie confocale ont révélé une colocalisation entre FLT3 et le marqueur autophagique LC3. Nous avons également confirmé sa présence dans les fractions enrichies en autophagosomes. De plus, la forme phosphorylée de STAT5, principal effecteur de la signalisation de FLT3-ITD, colocalise également avec LC3. L’ensemble de ces données suggère que FLT3-ITD pourrait signaler depuis les autophagosomes. En accord avec cette hypothèse, l’inhibition de l’autophagie s’accompagne d’une diminution de l’activation de STAT5, une voie essentielle à la survie et à la prolifération des blastes exprimant FLT3-ITD. L’autophagie entretient donc une relation fonctionnelle étroite avec l’axe FLT3-ITD/STAT5, et pourrait ainsi contribuer au maintien de la signalisation oncogénique favorisant la prolifération des cellules leucémiques.
En combinant des approches protéomiques et des modèles fonctionnels de perte d’autophagie, cette étude permet de mieux comprendre comment l’autophagie soutient la prolifération des blastes leucémiques. Nos résultats révèlent des rôles jusque-là méconnus de l’autophagie dans le maintien de l’intégrité nucléaire et dans la modulation de voies de signalisation oncogéniques. Ces travaux ouvrent la voie à l’identification de nouvelles vulnérabilités cellulaires exploitables en thérapie dans les LAM.
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Acute Myeloid Leukemias (AML) are hematological malignancies characterized by the uncontrolled proliferation and accumulation of immature leukemic cells, known as blasts, in the bone marrow and the blood of patients. AML remain a major therapeutic challenge due to their high genetic heterogeneity and cellular plasticity, which promote the emergence or selection of treatment-resistant clones, leading to frequent relapses and poor clinical outcomes.
Although autophagy is recognized as a mechanism promoting tumour cell survival, its non-canonical functions, particularly in the regulation of cellular signaling and cell proliferation, remain poorly understood.
In order to better understand its role in leukemic cells, we targeted ATG5, a key autophagy protein, using RNA interference (shRNA-ATG5) in the MOLM14 AML cell line. ATG5 depletion reduced cell expansion over time without inducing significant cell death. We then compared the proteomes of autophagy-competent (sh-CTL) and autophagy-deficient (sh-ATG5) cells using mass spectrometry (LC-MS/MS). Autophagy inhibition significantly altered the global proteome, particularly affecting the expression of proteins involved in cell cycle regulation and DNA replication. Consistent with these findings, flow cytometric analysis revealed a significant reduction in the percentage of sh-ATG5 cells in S phase. Notably, a similar phenotype was also observed ex vivo in primary cells obtained from six AML patients.
To identify autophagy-regulated proteins potentially involved in cell cycle control, we developed a method for autophagosome purification and analyzed their protein content by LC-MS/MS. Integration of these results with whole-cell proteomic analyses led to the identification of Lamin A/C, an essential protein involved in maintaining nuclear architecture and functions. Its presence within autophagosomes, as well as its accumulation in autophagy-deficient cells, was confirmed by Western blot analysis. These findings suggest that autophagy promotes cell-cycle progression in AML cells by regulating the half-life of Lamin A/C. By maintaining nuclear integrity, autophagy may thus contribute to the high proliferative capacity of leukemic blasts.
In parallel, we investigated the role of autophagy in the regulation of FLT3-ITD receptor-dependent signaling. Confocal microscopy analyses revealed colocalization of FLT3 with the autophagic marker LC3. We further confirmed the presence of FLT3 within autophagosomal fractions. Moreover, phosphorylated STAT5, the major downstream effector of FLT3 signaling, also colocalized with LC3. Taken together, these data suggest that FLT3-ITD may signal from autophagosomes. Consistent with this hypothesis, autophagy inhibition resulted in reduced STAT5 activation, a pathway essential for the survival and proliferation of FLT3-ITD-positive leukemic blasts. Autophagy therefore has a close functional relationship with the FLT3-STAT5 signaling axis, potentially contributing to the proliferative homeostasis of leukemic cells.
By combining proteomic approaches and functional models of autophagy deficiency, this study provides new insights into the mechanism by which autophagy supports leukemic blasts proliferation. Our results reveal a previously unappreciated role of autophagy in maintaining nuclear integrity and modulating oncogenic signaling pathways. This work opens the way to the potential identification of new cellular vulnerabilities that could be exploited in AML therapy. |