La perte des performances de production est un phénomène bien connu dans les bioprocédés bactériens axéniques, étroitement liée au grand nombre de générations impliquées dans les procédés industriels. Ce phénomène entraîne une diversification des populations au cours de la production, résultant de processus stochastiques associés au métabolisme cellulaire et à des mutations adaptatives en réponse à des conditions de stress. Les souches génétiquement modifiées sont particulièrement sujettes à ces instabilités. Dans ce travail, nous avons exploré l’effet de l’expression hétérologue plasmidique d’une voix de biosynthèse d’isopropanol sur la robustesse d’une souche de C. necator Re2133. A travers une évaluation technico-économique, nous avons mis en évidence que la stabilité de la souche a un impact significatif sur la viabilité économique de la bioproduction autotrophe d’isopropanol. Nos résultats soulignent ainsi l’importance de la robustesse de la souche et de la stabilité de l’expression.
Pour étudier l’instabilité de l’expression plasmidique à l’échelle de la cellule unique, un biocapteur a été développé dans des travaux antérieurs (C. Boy et al. 2022). La souche biocapteur co-exprime l’eGFP sous le contrôle d’un promoteur constitutif pLac, et l’opéron de synthèse de l’isopropanol sous le contrôle d’un promoteur inductible pBAD. Des cultures en mode fed-batch ont été réalisées avec ce biocapteur et comparées à une souche productrice d’isopropanol ainsi qu’à une souche productrice d’eGFP. Cette comparaison a mis en évidence des conflits d’interaction entre la voie de production d’isopropanol et le système rapporteur fluorescent. Cependant, les mécanismes d’hétérogénéité de l’expression plasmidique durant la production d’isopropanol restent à élucider.
Dans le cadre de cette thèse, les biais potentiels d’interprétation du signal du biocapteur en condition de production d’isopropanol ont été explorés, en mettant particulièrement l’accent sur les effets du photoblanchiment et de la stabilité de l’eGFP. Par la mise en œuvre de cultures en flask agitée et en bioréacteur, il a été déterminé que l’induction de l’opéron isopropanol entraînait une perte d’expression plasmidique, sans que cela soit dû à une limitation ou à la présence d’isopropanol. De plus, l’impact de la construction plasmidique sur la stabilité de la souche a été évalué. À cette fin, la structure plasmidique a été modifiée de deux manières : en remplaçant le squelette plasmidique et en supprimant les duplications géniques de l’opéron isopropanol. L’influence de la souche hôte sur la stabilité de l’expression plasmidique a également été examinée en utilisant la souche sauvage (H16) naturellement productrice de PHB, et une souche dérivée de la souche (H16) délété d’un mécanisme de défense putatif (H16 ∆Wadjet). Par ailleurs, l’impact du bioprocédé a été évalué en appliquant une pression de sélection via l’ajout de kanamycine par pulse ou de manière continue. Bien que ces approches n’aient pas stoppé la perte d’expression, cela a contribué à reconstituer la population exprimant le plasmide. Enfin, les mécanismes sous-jacents à la perte d’expression plasmidique ont été explorés en évaluant le nombre de copies du plasmide et en séquençant à partir d’échantillons issus de la biomasse totale ainsi que de colonies isolées. Ces travaux nous ont permis d’acquérir une meilleure compréhension des complexités liées à la perte plasmidique et de l’approche multidimensionnelle de C. necator pour surmonter cette expression restrictive.
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The loss of production has long been observed in axenic bacterial bioprocesses, and is known to be related to the many numbers of generations occurring in industrial processes. This leads to population diversification through stochastic processes surrounding cell metabolism and adaptive mutations in the presence of stress. Production instability is even more pronounced in engineered strains with plasmid-based production operons. In this work we have explored the effect of burdensome expression on strain expression stability using engineered Cupriavidus necator Re2133 with a plasmid-based recombinant isopropanol operon. Through techno-economic assessment, we have uncovered that strain stability has a large impact on the economic viability of the autotrophic bioproduction of isopropanol. Our results highlight the importance of expression stability. In order to study plasmid expression instability at single cell level, flow cytometry was used with a biosensing strain co-expressing eGFP constitutively under the non-native Lac promoter (Boy et al. (2022)). This sensor has been applied in fed-batch conditions parallel with an isopropanol producing strain and an eGFP-producing strain. This comparison highlighted conflicts in interactions between the isopropanol production pathway and the fluorescent reporter system. However, the mechanisms of plasmid expression heterogeneity during isopropanol expression have yet to be uncovered. In this work we have explored possible biases for faulty interpretation of the biosensor signal in the presence of isopropanol production including the effects of photobleaching and eGFP-stability. Furthermore, through shake flaks and bioreactor cultivations we have determined that the induction of the isopropanol operon led to the loss of plasmid expression. This was not caused by feed limitation, nor the presence of isopropanol. We explored whether the population heterogeneity concerning the plasmid expression stability could be influenced. To this end, the plasmid structure was altered in two ways: the plasmid backbone was exchanged, and gene duplications were removed from the isopropanol operon. Impact was seen on expression stability. The influence of the host strain on plasmid expression stability was also seen using PHB producer and PHB producer (H16) with the deletion of a putative defence mechanism (H16 DWadjet). The impact of the bioprocess was examined through continuous addition of selective pressure through kanamycin. Although this did not halt the expression loss, it did lead to the regaining of the plasmid-expressing population. Finally, we determined the mechanisms behind the plasmid expression loss through assessment of the plasmid copy number as well as through sequencing of the bulk biomass and single-cell colonies. With this work, a better understanding has been gained in the complexities of plasmid expression loss, and C. necator's multi-facetted approach to relieve itself of burdensome expression. |