Au sein du noyau des cellules eucaryotes, l'information génétique est organisée en chromatine, constituée d'unités répétées, les nucléosomes formés d'ADN s'enroulant autour d'un octamère d'histones (H2A, H2B, H3 et H4). Les histones canoniques peuvent être remplacées par des variants d'histones, qui altèrent la structure, l'accessibilité de la chromatine et l'expression génique. H2A.Z, un variant de l'histone canonique H2A, régule l'expression génique, la réplication et la réparation de l'ADN. Chez les vertébrés, H2A.Z est codé par deux gènes produisant deux isoformes (H2A.Z.1 et H2A.Z.2) qui diffèrent par trois acides aminés et présentent des fonctions à la fois redondantes et spécialisées. Chez l'Homme, H2A.Z est enrichi autour du site d'initiation de la transcription (TSS) des gènes actifs, bien que des données suggèrent qu'il pourrait également fonctionner en aval du TSS.
L'objectif de ma thèse était ainsi d'explorer ces fonctions de H2A.Z en aval du TSS. En utilisant la lignée cellulaire U2OS, j'ai généré des lignées dans lesquelles H2A.Z.1, H2A.Z.2, ou les deux isoformes, sont étiquetées avec FKBP, permettant une dégradation complète et rapide via le système inductible degron dTAG_V1, évitant ainsi les effets hors-cible et les effets indirects liés aux traitements longs nécessaires aux approches par siARN. Des expériences de ChIP-Seq ont montré que la co-dégradation des deux isoformes de H2A.Z entraîne une diminution de l'occupation en nucléosomes au TSS et leur remplacement par l'histone canonique H2A. De plus, alors que la déplétion d'une seule isoforme n'affecte pas la viabilité cellulaire, la co-déplétion des deux isoformes est létale, ce qui valide notre modèle.
Afin d'identifier de manière non biaisée les processus impliquant H2A.Z, j'ai réalisé un crible de létalité synthétique par knockout CRISPR-Cas9 à l'échelle du génome dans les deux lignées cellulaires H2A.Z.1-FKBP et H2A.Z.2-FKBP. La létalité synthétique entre la déplétion de H2A.Z.1-FKBP et le knockout de H2A.Z.2, et inversement, a servi de contrôle positif interne. L'analyse du crible a révélé un enrichissement significatif de gènes impliqués dans la terminaison de la transcription tels que CSTF3 et l'exonucléase XRN2. De plus, l'analyse de RNA-Seq après co-déplétion des isoformes de H2A.Z, a démontré une augmentation significative de la transcription read-through en aval des sites polyA, confirmant que H2A.Z est nécessaire pour une terminaison correcte de la transcription.
Ce crible a également révélé un lien génétique avec l'épissage, montrant un enrichissement en facteurs d'épissage. L'analyse de RNA-Seq totaux et de séquençage d’ARN naissants a confirmé que la co-déplétion des isoformes de H2A.Z entraîne une augmentation significative des défauts d'épissage, révélant un rôle de H2A.Z dans la maturation des pré-ARNm.
Pour étudier le mécanisme sous-jacent, je me suis concentrée sur la vitesse de l'ARN Polymérase II (ARN Pol II), qui présente une corrélation inverse avec l'occupation de H2A.Z et est connue pour contrôler la maturation des pré-ARNm. En utilisant des mutants d'ARN Pol II lents et rapides, j'ai montré que les défauts de terminaison et d'épissage induits par la déplétion de H2A.Z dépendent de la vitesse de la polymérase — une vitesse accrue accentuant ces défauts. Enfin, des expériences de TT-Chem-Seq après traitement au DRB ont révélé que la co-déplétion des isoformes de H2A.Z provoque une augmentation globale de la vitesse de l'ARN Pol II, en particulier le long des gènes présentant une transcription read-through et une rétention d'introns.
En conclusion, mon projet de thèse démontre pour la première fois que le variant d'histone H2A.Z est essentiel pour la maturation des ARNm, spécifiquement pour l'épissage et la terminaison de la transcription. Sur le plan mécanistique, H2A.Z régule la vitesse de l'ARN Pol II : sa perte accélère la vitesse de transcription, ce qui conduit à des défauts de terminaison de la transcription et d'épissage.
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Within the nucleus of eukaryotic cells, the genetic information is organized into chromatin, consisting of repeating nucleosome units where DNA wraps around a histone octamer (H2A, H2B, H3, and H4). Canonical histones can be replaced by histone variants, which alter chromatin structure, accessibility, and gene expression. H2A.Z, a variant of H2A, regulates gene expression, DNA replication, and DNA repair. In vertebrates, H2A.Z is encoded by two genes producing two isoforms (H2A.Z.1 and H2A.Z.2) that differ by three amino acids and exhibit both redundant and specialized functions. In humans, H2A.Z is enriched around the transcription start site (TSS) of active genes, though evidences suggest it may also function downstream of the TSS.
The aim of my PhD was to investigate these downstream functions of H2A.Z. Using U2OS cells, I generated cell lines where H2A.Z.1, H2A.Z.2, or both isoforms are FKBP-tagged, allowing complete and rapid degradation within 12 hours via the dTAG_V1 Degron Inducible system, avoiding off-target and indirect effects associated to long treatments with siRNA. ChIP-Seq experiments showed that degradation of both isoforms together leads to a decrease in nucleosome occupancy at the TSS and replacement of H2A.Z by canonical H2A rather than another variant. Moreover, whereas single-isoform depletion doesn’t affect cell viability, co-depletion of both isoforms is lethal, validating our model.
To identify, in an unbiased way, processes involving H2A.Z, I conducted a genome-wide CRISPR-knockout synthetic lethality screen targeting over 19,000 genes in both H2A.Z.1-FKBP and H2A.Z.2-FKBP cell lines. Synthetic lethality between H2A.Z.1-FKBP depletion and H2A.Z.2 knockout, and vice versa, served as an internal positive control. Screen analyses revealed a significant enrichment of genes involved in RNA processing pathways, particularly key transcription termination factors such as CSTF3 and the exonuclease XRN2. Moreover, RNA-Seq analyses following co-depletion of both H2A.Z isoforms, demonstrated a significant increase in read-through transcription downstream of polyA sites, confirming that H2A.Z is required for proper transcription termination.
The screen also revealed a genetic link to splicing, showing enrichment for splicing factors. Analysis of both total and nascent RNAs sequencing confirmed that co-depletion of both H2A.Z isoforms causes a significant increase in splicing defects, revealing a role for H2A.Z in pre-mRNA processing.
To investigate the underlying mechanism, I focused on RNA Polymerase II (RNA Pol II) speed, which has been shown to regulate both transcription termination and splicing, and inversely correlates with H2A.Z occupancy. Using slow and fast RNA Pol II mutants, I showed that transcription termination and splicing defects induced by H2A.Z depletion depend on polymerase speed—increased speed enhances these defects. Finally, TT-Chem-Seq experiments following DRB treatment revealed that H2A.Z isoforms co-depletion causes a global increase in RNA Pol II velocity, particularly across genes exhibiting read-through transcription and intron retention.
In conclusion, my PhD project demonstrates for the first time that the histone variant H2A.Z is essential for pre-mRNA processing, specifically splicing and transcription termination. Mechanistically, H2A.Z regulates RNA Pol II speed, and its loss accelerates transcription, leading to defects in transcription termination and splicing.
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