La lignocellulose, principal composant structurel de la paroi cellulaire végétale, est la ressource organique renouvelable la plus abondante sur Terre. Certaines bactéries anaérobies dégradent efficacement cette biomasse grâce à des cellulosomes, des complexes multienzymatiques extracellulaires aux propriétés catalytiques exceptionnelles. Ces systèmes naturels ont inspiré le développement de cellulosomes de conception, mais leur architecture, basée sur des interactions non covalentes entre cohésine et dockérine, limite le contrôle précis des enzymes fusionnées en raison de leur flexibilité et des risques de réactivité croisée.
Ce projet explore une alternative : un système d’assemblage covalent, appelé Jo-In, dérivé de l’adhésine RrgA de Streptococcus pneumoniae. Ce système permet la formation spontanée et irréversible d’une liaison isopeptidique intramoléculaire, offrant une stabilité structurale accrue. Validé pour la fusion enzymatique in vitro, le projet vise à identifier et caractériser des paires Jo-In orthogonales, permettant un assemblage modulaire d’enzymes avec une stœchiométrie définie et une stabilité améliorée. Ces complexes pourraient non seulement optimiser la dégradation de la lignocellulose, mais aussi servir de plateforme pour étudier la synergie enzymatique dans divers contextes biologiques.
Pour y parvenir, deux approches complémentaires ont été adoptées. La première repose sur la construction et le criblage d’une librairie de mutants Jo-In. La formation de la liaison isopeptidique entre les modules Jo et In suit un mécanisme en deux étapes : une phase de reconnaissance, où des interactions non covalentes transitoires se forment, suivie de la formation de la liaison covalente. Le mutant InR711E, qui empêche la reconnaissance correcte de Jo, a servi de base pour concevoir des bibliothèques semi-rationnelles visant à restaurer cette étape tout en garantissant l’orthogonalité des paires.
La deuxième approche exploite la diversité biologique naturelle des paires Jo-In. Nous avons étudié des paires issues de bactéries comme Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes et Chlamydia trachomatis. Chaque protéine a été produite isolément, et toutes les combinaisons entre Jo et In ont été testées pour identifier des paires orthogonales. La formation des complexes a été confirmée par électrophorèse SDS-PAGE.
Une caractérisation biophysique et structurale approfondie des complexes Jo-In a été réalisée par cristallographie aux rayons X, révélant une interface étendue stabilisée par deux ponts salins conservés. Ces données ont permis de concevoir des mutations rationnelles ciblant la formation du complexe. Des expériences de diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ont également été menées pour étudier la forme et la taille d’une paire Jo-In nouvellement conçue.
Enfin, une recherche systématique d’autres protéines présentant des liaisons isopeptidiques, notamment parmi les adhésines et les pili, a permis d’identifier de nouveaux candidats. Ces travaux visent à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’interaction Jo-In, offrant une base pour la conception future de paires orthogonales optimisées.
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Lignocellulose, the primary structural component of the plant cell wall, is the most abundant renewable organic resource on Earth. Certain anaerobic bacteria efficiently degrade this biomass through cellulosomes, extracellular multi-enzyme complexes renowned for their exceptional catalytic properties. These natural systems have inspired the development of designer cellulosomes (DCs). However, their architecture, which relies on non-covalent interactions between cohesin and dockerin modules, limits precise control over fused enzymes due to their intrinsic flexibility and the risk of cross-reactivity.
This project explores an innovative alternative: a covalent assembly system termed Jo-In, derived from the Streptococcus pneumoniae adhesin RrgA. This system enables the spontaneous and irreversible formation of an intramolecular isopeptide bond, providing enhanced structural stability. Validated for in vitro enzymatic fusion, the project aims to identify and characterize orthogonal Jo-In pairs, enabling the modular assembly of multi-component enzymes with defined stoichiometry and improved stability. These complexes could not only optimize lignocellulose degradation but also serve as a platform to study enzymatic synergy across various biological contexts.
To achieve this, two complementary approaches were adopted. The first involved the construction and screening of a Jo-In mutant library. The formation of the isopeptide bond between Jo and In modules follows a two-step molecular mechanism: a recognition phase, where transient yet essential non-covalent interactions occur, followed by covalent bond formation. The InR711E mutant, which disrupts proper Jo recognition, served as a foundation for designing semi-rational libraries aimed at restoring this step while ensuring the orthogonality of the pairs.
The second approach leveraged the natural biological diversity of Jo-In pairs. Pairs from bacteria such as Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus pyogenes, and Chlamydia trachomatis were investigated. Each protein was produced in isolation, and all possible combinations between Jo and In modules were tested to identify orthogonal pairs. Complex formation was confirmed via SDS-PAGE electrophoresis.
A comprehensive biophysical and structural characterization of Jo-In complexes was conducted using X-ray crystallography, revealing an extensive interface stabilized by two conserved salt bridges. These findings enabled the design of rational mutations targeting complex formation. Additionally, Small-Angle X-ray Scattering (SAXS) experiments were performed to investigate the shape and size of a newly designed Jo-In pair.
Finally, a systematic search for other proteins containing isopeptide bonds, particularly among adhesins and pili, identified new candidates. This work aims to elucidate the underlying molecular mechanisms of Jo-In interactions, providing a foundation for the future design of optimized orthogonal pairs.
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