Les leishmanioses sont des maladies parasitaires causées par des protozoaires du genre Leishmania, responsables d’un large éventail de manifestations cliniques. Les traitements actuels deviennent limités par leur toxicité, leur coût et l’émergence de résistances, tandis que le réchauffement climatique étend les zones à risques des maladies. Au cours de leur cycle de vie, ces parasites alternent essentiellement entre deux stades : les promastigotes, flagellés, présents chez le phlébotome, l’insecte vecteur, et les amastigotes, forme pathogène intracellulaire, qui prolifèrent au sein des macrophages de l’hôte vertébré. La transition entre ces stades, essentielle à l’établissement de l’infection, s’accompagne d’une profonde reprogrammation métabolique et d’une adaptation à un environnement intracellulaire particulièrement hostile, marqué par l’acidité, la chaleur et un stress oxydant intense. Un élément central de la réponse de Leishmania à ces contraintes est son système antioxydant, qui repose quasi exclusivement sur le trypanothion. Ce thiol, spécifique des Kinétoplastidés, constitue l’analogue fonctionnel du glutathion des autres eucaryotes et assure la réduction des ROS en transmettant les électrons du NADPH à travers un réseau enzymatique spécialisé. Plusieurs études suggèrent que les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote produits par le macrophage pourraient agir comme signaux déclencheurs de la différenciation chez Leishmania. Mieux comprendre les mécanismes responsables de la transition de stade pourrait ouvrir la voie vers de nouvelles pistes thérapeutiques. L’objectif de cette thèse a été d’explorer l’effet spécifique de différentes espèces réactives vis-à-vis de la transition de stade en étudiant des modulations morphologiques, transcriptionnelles, et protéiques, ainsi qu’au moyen d’une approche de métabolomique non-ciblée. Nous nous sommes également intéressés à l’évolution du système antioxydant qui accompagne cette transition en évaluant la capacité des parasites à maintenir leur homéostasie redox globale et notamment des quantités de trypanothion réduit suffisantes. Pour mener a bien ce dernier objectif une méthode de dosage UHPLC-HRMS de la balance trypanothion réduit et oxydé a été proposée. Cette approche, basée sur la dérivatisation des thiols libres par le N-Ethylmaléimide, fournit un marqueur de l’état redox intracellulaire. La méthode s’est révélée robuste et sensible, capable de détecter des perturbations de l’équilibre redox en réponse à un stress oxydant ou à une inhibition pharmacologique de la trypanothion réductase. Nos travaux ont ensuite permis de montrer que parmi les espèces réactives testées à des doses sublétales (peroxyde d’hydrogène, superoxyde et monoxyde d’azote), H2O2 entraîne des effets plus modérés, tandis que le NO• est l’espèce réactive qui entraîne une reprogrammation transcriptionnelle et métabolomique la plus proche de celle des amastigotes, ainsi que l’induction de la protéine amastine, spécifique au stade amastigote. Cependant, cette induction reste incomplète, notamment au niveau morphologique et sur une partie du métabolome. Ces résultats ont été confirmé en suivant l’évolution des défenses antioxydantes de Leishmania au cours de la différenciation et en réponse aux ROS. Les amastigotes présentent une meilleure capacité à maintenir leur homéostasie redox, leurs réserves de trypanothion réduit, et une régulation positive de nombreux gènes antioxydants (fesod, apx, txnpx, tryr, trys, g6pd). De plus, une exposition préalable des promastigotes au NO• entraîne une réponse transcriptionnelle et une stabilité redox accrue qui rapprochent leur profil de celui des amastigotes. Ces résultats démontrent qu’au-delà de leur rôle microbicide au sein du macrophage, ces espèces réactives, notamment le NO•, agissent également chez Leishmania comme signaux déclencheurs clés de la transition promastigote-amastigote, préparant les parasites à leur environnement intracellulaire. |
Leishmaniases are parasitic diseases caused by protozoa of the genus Leishmania, responsible for a wide spectrum of clinical manifestations. The current treatments faced limitations because of their toxicity, their cost, and the emergence of resistance. Besides, global warming is expanding the areas at risk of diseases. Throughout their life cycle, these parasites mainly alternate between two main stages: flagellated promastigotes, found in the sand fly vector, and intracellular amastigotes, the pathogenic form that proliferates within macrophages of the vertebrate host. This stage transition, essential for infection establishment, involves profound metabolic reprogramming and adaptation to a highly hostile intracellular environment characterized by acidity, elevated temperature, and intense oxidative stress. A central component of Leishmania’s response to these constraints is its antioxidant system, which relies almost exclusively on trypanothione. This thiol, specific to kinetoplastids, represents the functional analogue of other eukaryotes’ glutathione and ensures the reduction of ROS by transferring electrons from NADPH through a specialized enzymatic network. Several studies suggest that reactive oxygen and nitrogen species produced by macrophages may act as triggering signals of differentiation in Leishmania. A better understanding of the mechanisms underlying stage transition could open new therapeutic avenues. The objective of this thesis was therefore to investigate the specific effect of different reactive species on stage differentiation, by assessing morphological, transcriptional, and protein modulations, as well as through an untargeted metabolomics approach. We also focused on the evolution of the antioxidant system accompanying this transition, evaluating the parasites’ ability to maintain global redox homeostasis and, in particular, sufficient levels of reduced trypanothione. To achieve this, we developed an original UHPLC-HRMS quantification method for reduced and oxidized trypanothione. This approach, based on derivatization of free thiols by N-Ethylmaleimide, provides a reliable marker of the intracellular redox state. The method proved robust and sensitive, capable of detecting shifts in redox balance in response to oxidative stress or pharmacological inhibition of trypanothione reductase. Our work then showed that among the reactive species tested at sublethal doses (hydrogen peroxide, superoxide, and nitric oxide), nitric oxide (NO•) was the one inducing the transcriptional and metabolomic reprogramming most similar to that of amastigotes, along with the induction of amastin, a protein specific to the amastigote stage. H2O2 induced more moderate effects. However, the differentiation remained incomplete, particularly at the morphological level and for part of the metabolome. These findings were confirmed by monitoring the evolution of Leishmania’s antioxidant defences during differentiation and upon exposure to reactive species. the evolution of Leishmania’s antioxidant defences during differentiation and in response to ROS. Amastigotes displayed an enhanced ability to maintain redox homeostasis and its reduced trypanothione pool, and upregulation of numerous antioxidant genes (fesod, apx, txnpx, tryr, trys, g6pd). Moreover, prior exposure of promastigotes to NO• resulted in transcriptional changes and improved redox stability, bringing their profile closer to that of amastigotes. Altogether, these results demonstrate that beyond their microbicidal role in the macrophage, reactive oxygen and nitrogen species, particularly NO•, also act in Leishmania as key signalling molecules initiating promastigote-to-amastigote transition and preparing the parasite for its intracellular environment. |