Les phosphoinositides (PIPs) constituent une famille quantitativement mineure de phospholipides membranaires régulant de nombreux processus cellulaires, notamment le trafic intracellulaire. Leur importance physiologique est soulignée par l’existence de plusieurs maladies humaines liées à des mutations des kinases et phosphatases contrôlant leur métabolisme. MTM1 est une PI 3-phosphatase qui catalyse la conversion du PI3P en PI et du PI(3,5)P2 en PI5P, des PIPs considérés comme des régulateurs clés de la dynamique membranaire et du trafic intracellulaire.
Des mutations du gène MTM1 sont responsables de la myopathie myotubulaire liée à l’X (XLMTM), une maladie congénitale rare et sévère du muscle squelettique pour laquelle aucun traitement curatif n’existe à ce jour. Toutefois, dans des modèles expérimentaux, l’inactivation de la phosphoinositide 3-kinase de classe II β (PI3KC2β), qui catalyse la synthèse du PI3P à partir du PI, permet de corriger les phénotypes pathologiques. Parmi ceux-ci, l’analyse de biopsies musculaires humaines a mis en évidence une altération du trafic de l’intégrine β1, caractérisée par une accumulation anormale dans les fibres musculaires, contribuant probablement aux défauts d’adhésion observés.
Mon travail de thèse a consisté à caractériser le rôle de MTM1 dans la régulation du trafic de l’intégrine β1. À l’aide de cellules musculaires squelettiques C2C12 knockout pour Mtm1, nous avons démontré que, dans les conditions physiologiques, la majeure partie du PI3P est localisée sur les endosomes de recyclage Rab4-positifs. La perte de MTM1 induit une accumulation de PI3P sur les endosomes précoces EEA1-positifs et altère la biogenèse des vésicules de recyclage Rab4-positives. L’inactivation de la PI3KC2β normalise les niveaux de PI3P sur les endosomes précoces EEA1-positifs et restaure la formation des vésicules Rab4-positives. Ces résultats identifient MTM1 comme une enzyme clé du maintien de l’homéostasie du trafic endosomal, suggérant que son déficit perturbe le recyclage des cargos via des voies dépendantes de Rab4, incluant potentiellement l’intégrine β1.
Afin d’analyser le trafic de cette intégrine, nous avons généré des lignées cellulaires C2C12 (WT et Mtm1-KO) exprimant l’intégrine β1 endogène étiquetée par la protéine Clover au niveau d’une boucle extracellulaire n’interférant pas avec sa fonction. Dans ce modèle, l’absence de MTM1 entraîne une accumulation de l’intégrine β1 dans de larges structures vésiculaires de plusieurs micromètres de diamètre, associée à un phénotype de détachement cellulaire. La microscopie électronique à transmission a révélé que ces vésicules sont majoritairement claires aux électrons, tandis que l’imagerie confocale a démontré qu’il s’agit de structures hautement dynamiques générées par une endocytose dépendante de la dynamine. De façon notable, ces vésicules sont positives pour la cavéoline-1, suggérant l’implication d’une voie d’endocytose associée aux cavéoles. De plus, leur formation semble dépendante du PI3P, puisque la déplétion de PI3KC2β en prévient l’apparition. Ainsi, en accord avec la littérature, nos résultats suggèrent que l’absence de MTM1 entraîne une accumulation pathologique de PI3P au niveau des endosomes précoces EEA1-positifs, induisant une expansion aberrante de ces compartiments par fusion avec des cavéoles. Il est à noter que ce phénotype est également retrouvé dans des cellules d’un patient atteint de XLMTM.
En conclusion, nos résultats identifient MTM1 comme un régulateur essentiel du trafic de l’intégrine β1 et suggèrent qu'une altération de l’homéostasie endocytaire constitue un facteur moteur du détachement et de l’atrophie musculaires observés dans l’XLMTM.
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Phosphoinositides (PIPs) constitute a quantitatively minor family of membrane phospho-lipids regulating numerous cellular processes, including intracellular trafficking. Their physiolo-gical importance is underscored by the existence of several human diseases linked to mutations in the kinases and phosphatases that control their metabolism. MTM1 is a PI 3-phosphatase that catalyzes the conversion of PI3P into PI and PI(3,5)P2 into PI5P, PIPs considered to be key regu-lators of membrane dynamics and intracellular trafficking.
Mutations in the MTM1 gene are responsible for X-linked myotubular myopathy (XLMTM), a rare and severe congenital disease of skeletal muscle for which no curative treatment currently exists. However, in experimental models, inactivation of class II β phos-phoinositide 3-kinase (PI3KC2β), which catalyzes the synthesis of PI3P from PI, corrects the pathological phenotypes. Among these, the analysis of human muscle biopsies revealed an al-teration of integrin β1 trafficking, characterized by an abnormal accumulation in muscle fibers, likely contributing to the observed adhesion defects.
My thesis work focused on characterizing the role of MTM1 in regulating β1 integrin trafficking. Using Mtm1-knockout C2C12 skeletal muscle cells, we demonstrated that, under physiological conditions, the majority of PI3P is localized on Rab4-positive recycling en-dosomes. The loss of MTM1 leads to an accumulation of PI3P on early EEA1-positive en-dosomes and impairs the biogenesis of Rab4-positive recycling vesicles. Inactivation of PI3KC2β normalizes PI3P levels on early EEA1-positive endosomes and restores the formation of Rab4-positive vesicles. These results identify MTM1 as a key enzyme in maintaining en-dosomal trafficking homeostasis, suggesting that its deficiency disrupts cargo recycling via Rab4-dependent pathways, potentially including integrin β1.
In order to analyze the trafficking of this integrin, we generated C2C12 cell lines (WT and Mtm1-KO) expressing endogenous β1 integrin tagged with Clover protein in an extracellular loop that does not interfere with its function. In this model, the absence of MTM1 leads to an accumulation of β1 integrin in large vesicular structures several micrometers in diameter, associated with a cell detachment phenotype. Transmission electron microscopy revealed that these vesicles are predominantly electron-lucent, while confocal imaging demonstrated that they are highly dynamic structures generated by dynamin-dependent endocytosis. Notably, these vesicles are positive for caveolin-1, suggesting the involvement of a caveolae-associated endocytosis pathway. Moreover, their formation appears to be PI3P-dependent, since depletion of PI3KC2β prevents their formation. Thus, in agreement with the literature, our results suggest that the absence of MTM1 leads to a pathological accumulation of PI3P in EEA1-positive early endosomes, inducing an aberrant expansion of these compartments by fusion with caveolae. It should be noted that this phenotype is also observed in cells from a patient with XLMTM.
In conclusion, our results identify MTM1 as a key regulator of β1 integrin trafficking and suggest that an alteration in endocytic homeostasis is a driving factor behind the muscle detachment and atrophy observed in XLMTM.
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