Mincle (Macrophage-inducible C-type lectin) est un récepteur transmembranaire appartenant à la famille des lectines de type C qui est exprimé à la surface des cellules immunitaires, jouant un rôle clé dans l’immunité via la reconnaissance de motifs moléculaires pathogènes. Dans un contexte d'infection par Mycobacterium tuberculosis, agent responsable de la Tuberculose, Mincle lie le tréhalose dimycolate (TDM) par l'intermédiaire du domaine de reconnaissance des carbohydrates (CRD) dans la région extracellulaire, ce qui induit une forte réponse immunitaire. La liaison des ligands par Mincle active la transduction du signal par la phosphorylation du motif d’activation des récepteurs immuns basé sur la tyrosine dans le domaine intracellulaire de FcRɣ, le partenaire de signalisation de Mincle. Cette phosphorylation active la spleen tyrosine kinase, puis la voie CARD9-Bcl10-Malt1, ce qui entraîne une réponse pro-inflammatoire. Une telle voie de signalisation est nécessaire pour l'activité adjuvante du TDM, ainsi que de son analogue synthétique, le tréhalose dibéhénate (TDB), qui est caractérisée par une réponse immunitaire de type Th1 et Th17. Pour ces raisons, Mincle a été identifié comme une cible potentielle pour le développement de nouveaux adjuvants dans un contexte de vaccination contre la Tuberculose. Les études structurales antérieures ont montré la présence de trois sites de liaison aux ions calcium. La structure cristalline du CRD de Mincle montre un site d’interaction avec le tréhalose centré autour d’un ion calcium. La chaîne lipidique s’insère quant à elle dans un sillon hydrophobe formé par quatre résidus hydrophobes.
Ce projet de thèse vise à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le récepteur Mincle permet la réponse immunitaire à la suite de la détection des ligands portés par Mycobacterium tuberculosis, afin de guider le développement de nouveaux adjuvants ciblant Mincle. Pour ce faire, nous avons intégré diverses approches de biophysique expérimentale telles que la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire, le titrage calorimétrique isotherme ainsi que la diffusion des rayons X aux petits angles, avec des calculs de dynamique moléculaire, auxquels nous avons couplé des mesures d’énergie libre.
Dans un premier temps, la purification du domaine CRD de Mincle a permis son étude structurale et dynamique à l'échelle atomique. Nous avons déterminé l’affinité de Mincle vis-à-vis de divers ligands, démontrant l’importance de la chaîne lipidique pour la reconnaissance par Mincle. Ces travaux sont caractérisés par une forte complémentarité entre les techniques. Par ailleurs, un protocole de perturbation d’énergie libre a été utilisé pour déterminer l’affinité de chaque site de liaison de Mincle pour les ions Ca2+. De plus, ces travaux ont montré l’oligomérisation du domaine CRD induite par la reconnaissance des glycolipides de manière dépendante des ions Ca2+, suggérant un mécanisme d’activation du signal lors de l’infection, où l’abondance de motifs moléculaires exogènes pourrait induire le regroupement de Mincle pour amplifier la réponse immunitaire.
Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la protéine pleine taille dans un contexte lipidique. Bien que la purification de cette protéine soit complexe, les résultats obtenus sont prometteurs pour sa future purification dans un environnement lipidique. En parallèle, des approches de modélisation multi-échelle ont été déployées pour simuler le complexe Mincle-FcRɣ en présence de ligands. Ces simulations ont montré un comportement différent des glycolipides vis-à-vis de la membrane selon leur solubilité.
Ces travaux s'intègrent dans la compréhension de la signalisation induite par Mincle afin de guider le développement de nouveaux adjuvants vaccinaux contre la tuberculose, une maladie dont l'émergence de souches multi-résistantes nécessite la mise au point de nouvelles stratégie thérapeutique. |
Mincle (Macrophage-inducible C-type lectin) is a transmembrane receptor belonging to the C-type lectin family. It is expressed on the surface of immune cells and plays a key role in immunity through the recognition of pathogen-associated molecular patterns. In the context of infection by Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, Mincle binds trehalose dimycolate (TDM) via its extracellular carbohydrate recognition domain (CRD), triggering a robust immune response. The binding of ligand by Mincle activates signal transduction through the phosphorylation of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif in the intracellular domain of FcRγ, Mincle's signaling partner. This phosphorylation activates spleen tyrosine kinase, followed by the CARD9-Bcl10-Malt1 pathway, leading to a pro-inflammatory response. Such signaling pathway is required for the adjuvant activity of TDM, as well as its synthetic analogue, trehalose dibehenate (TDB), which is characterized by a Th1 and Th17 immune response. For these reasons, Mincle has been identified as a potential target for the development of new adjuvants for tuberculosis vaccination. Previous structural studies have shown the presence of three calcium ion-binding sites. The crystal structure of the Mincle CRD reveals a trehalose interaction site centered around a calcium ion. The lipid chain, on the other hand, inserts into a hydrophobic groove formed by four hydrophobic residues.
In this context, this PhD project aims to elucidate the molecular mechanisms by which the Mincle receptor drives the immune response following the detection of ligands carried by Mycobacterium tuberculosis, in order to guide the development of new adjuvants targeting Mincle. To achieve this, we integrated various experimental biophysics approaches, such as nuclear magnetic resonance spectroscopy, isothermal titration calorimetry, and small-angle X-ray scattering, with molecular dynamics calculations coupled with free energy measurements.
In the first part of this work, the purification of the Mincle CRD allowed for its structural and dynamic study at the atomic scale. We determined the affinity of Mincle for various ligands, demonstrating the importance of the lipid chain in ligand recognition by Mincle. These studies are characterized by a strong complementarity between the techniques used. Furthermore, an alchemical free energy perturbation protocol was used to determine the affinity of each Mincle binding site for Ca2+ ions. Additionally, this work demonstrated the glycolipid-induced oligomerization of the CRD domain in a Ca2+-dependent manner, suggesting a signal activation mechanism during infection where the abundance of exogenous molecular patterns could induce Mincle clustering to amplify the immune response.
In the second part, we focused on the full-length protein within a lipid context. Although the purification of this protein remains complex, the results obtained are promising for its future purification in a lipid environment. In parallel, multiscale modeling approaches were used to simulate the Mincle-FcRγ complex in the presence of ligands. These simulations revealed a distinct behavior of the glycolipids toward the membrane depending on their solubility.
Overall, this work contributes to a deeper understanding of Mincle-induced signaling to guide the development of new vaccine adjuvants against tuberculosis, a disease for which the emergence of multi-drug resistant strains necessitates the development of novel therapeutic strategies. |