L'augmentation des émissions de CO2 nécessite des alternatives pour réutiliser cette source de carbone abondante mais sous-exploitée. Une approche prometteuse et utiliser le CO2 comme source de carbone pour soutenir les organismes autotrophes, et réaliser la biosynthèse des produits d'intérêt. Les microorganismes autotrophes assimilent naturellement le CO2 et utilisent la lumière ou des composés inorganiques comme sources d'énergie. Cependant, ces nécessitent encore du génie génétique pour répondre aux exigences de productivité et d'efficacité industrielles. Parmi eux, Cupriavidus necator est une bactérie chimiolithotrophe facultative qui utilise le CO2 comme seule source de carbone, l'H2 comme source d'énergie et l'O2 comme accepteur d'électrons. Son métabolisme a permit la production de diverses molécules d'intérêt commercial, mais peu d'études ont été fait sur l'utilisation du H2 pour obtenir des produits chimiques fins.
Dans cette étude, un nouveau procédé a été exploré pour obtenir des molécules à haute valeur ajoutée chez C. necator à l'aide d'une cascade d'enzymes alimentée en H2. La production d'hétérocycles azotés (N-hétérocycles) a cause de son importance dans la production de produits pharmaceutiques. La thèse utilise trois oxydoréductases différentes pour établir une cascade enzymatique fonctionnelle in vivo chez C. necator. La cascade se compose de variants hétérologues de la putrescine oxydase (PuOx) dépendante de l'O2, de l'imine réductase (IRED) dépendante du NADH et de l'hydrogénase soluble dépendant à le NAD+ (SH) qui est native de C. necator et est utilisée pour le recyclage des cofacteurs.
C. necator a été génétiquement modifié pour produire les variants hétérologues de PuOx et IRED. La production protéique a été testée en conditions hétérotrophes sur milieu minimal, avec plusieurs souches évaluées pour améliorer l’expression. Des essais enzymatiques ont confirmé l’activité de l’IRED dans l’extrait soluble. La production de PuOx et d’IRED a également été observée sous conditions hétérotrophes et lithoautotrophes.
En parallèle, la transition de l’hétérotrophie à la lithoautotrophie a été optimisée en comparant des précultures sur fructose ou glycérol. Une stratégie en trois étapes, utilisant du glycérol en dernière préculture, a permis de réduire significativement la phase de latence des cultures lithoautotrophes. Ce protocole a également servi à évaluer l’effet de la putrescine, substrat potentiel de la cascade. Les analyses de croissance et de cytométrie ont montré que C. necator tolère jusqu’à 100 mM de putrescine sans impact majeur sur le taux de croissance spécifique, bien qu’une phase de latence prolongée et une modification de la morphologie cellulaire aient été observées.
C. necator a été modifié pour la co-expression de PuOx et IRED. Les premières expériences avec la cascade enzymatique ont révélé des difficultés dans l'étape catalysée par PuOx. Des analyses ont confirmé que la réaction catalysée par l'IRED avait une conversion de 0,8 % après 48 h de biotransformation en lithoautotrophie. L'expression de l'IRED a été optimisé, et les performances de biotransformation ont été comparé entre conditions hétérotrophes et lithoautotrophes. Après optimisation, une conversion de 67 % a été obtenu en 24 h en lithoautotrophie avec un mélange de gaz non explosif, plus rapide que dans des conditions hétérotrophes.
Cette étude a établi les bases d'une stratégie de biotransformation robuste chez C. necator, démontrant son potentiel en tant qu'hôte microbien durable pour la production de N-hétérocycles. Les travaux futurs se concentreront sur l'optimisation de la productivité, l'amélioration de l'expression de PuOx et le traitement en aval. En intégrant des oxydoréductases dans le métabolisme à base d'H2 de C. necator, cette recherche met en évidence le potentiel des biotransformations lithoautotrophes et positionne C. necator comme un microorganisme clé dans la transition vers une bioéconomie basée sur le CO2. |
The increasing CO2 emissions require sustainable alternatives to repurpose this abundant yet undervalued carbon source. A promising approach is using CO2 as carbon source to sustain autotrophic organisms, while performing biosynthesis of products of interest. Autotrophic organisms naturally assimilate CO2 as a carbon source and use light or inorganic compounds as energy sources. However, autotrophic systems still require genetic engineering to meet industrial productivity and efficiency demands. Among autotrophic microorganisms, Cupriavidus necator is a facultative chemolithotroph using CO2 as sole carbon source, H2 as energy source, and O2 as electron acceptor. Although this metabolic versatility allows C. necator to produce diverse molecules of commercial interest, few studies have focused on using its H2-driven metabolism to obtain fine chemicals.
This study explored a new process to obtain high-value molecules in C. necator using a H2-driven enzymatic cascade. Production of Nitrogen heterocycles (N-heterocycles) was selected because of their relevance across the chemical industry, notably as building blocks in pharmaceuticals. The thesis used three oxidorreductases, to establish a functional in vivo enzymatic cascade in C. necator. The enzymatic cascade consists of heterologous variants of O2-dependent putrescine oxidase (PuOx), NADH-dependent imine reductase (IRED), and the native NAD+-dependent soluble hydrogenase (SH) from C. necator for cofactor recycling.
C. necator was engineered for the heterologous production of PuOx and IRED variants, and protein production was evaluated under heterotrophic conditions with minimal media. Several strains were tested to improve protein production, and enzymatic assays were performed, confirming that IRED was active in the soluble extract of C. necator. Moreover, PuOx and IRED production were observed in individual C. necator strains in both heterotrophic and lithoautotrophic conditions.
In parallel, the transition from heterotrophy to lithoautotrophy was compared using fructose or glycerol in the preculture medium. A three-step culture with glycerol in the last preculture medium resulted in an optimized protocol reducing the start of lithoautotrophic cultures in C. necator. The optimized protocol was used to assess the effect of putrescine, a potential substrate for the enzymatic cascade. Analyses revealed that putrescine is not toxic for C. necator in lithoautotrophic conditions, tolerating up to 100 mM putrescine with minimal impact on specific growth rate, but causing an extended lag phase and changing cell’s morphology. The optimized protocol was used to evaluate the assembled enzymatic cascade in engineered strains.
C. necator was further engineered to combine PuOx and IRED. Initial experiments with the enzymatic cascade revealed challenges in the step catalyzed by PuOx. Nonetheless, further analysis confirmed that the IRED-catalyzed reaction proceeded within C. necator, reaching 0.8 % conversion after 48 h of biotransformation under lithoautrophic conditions. Focusing on this step, IRED expression was optimized, and biotransformation performance was compared under both heterotrophic and lithoautotrophic conditions. An increase to 67 % conversion was observed after 24 h of lithoautotrophic biotransformation with a safe-gas mixture, faster than in heterotrophic conditions.
This study established the basis for a robust biotransformation strategy in C. necator, demonstrating its potential as a sustainable microbial host for N-heterocycle production. Future work will focus on optimizing productivity, improving PuOx expression, and downstream product extraction. By integrating oxidoreductases with C. necator’s H2-driven metabolism, this research highlights the potential of lithoautotrophic biotransformations, and positions C. necator as a key microorganism in the transition towards a CO2-based bioeconomy.
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