Les cultures autotrophes sont une voie prometteuse pour valoriser les gaz à effet de serre à la production de produits à valeur ajoutée, en exploitant le potentiel de micro-organismes capables d’utiliser le dioxyde de carbone comme source de carbone. La bactérie Cupriavidus necator est capable d’utiliser le CO2 comme source de carbone, l’O2 comme accepteur d’électrons et l’H2 comme source de pouvoir réducteur. Elle produit naturellement du polyhydrohybutyrate (PHB) comme substance de réserve, et a été génétiquement modifié pour détourner le flux de carbone du PHB vers d’autres produits d’intérêt, tels que l’isopropanol. L’isopropanol est un produit chimique largement utilisé comme détergent ou additif dans les cosmétiques. Cet alcool a été choisi dans cette étude comme composé modèle non seulement pour son intérêt économique mais aussi car sa synthèse dans C. necator part d’intermédiaires métaboliques communs à la voie de synthèse de PHB. Sa toxicité envers la bactérie permet d’aborder également l’impact d’un produit inhibiteur. Les cultures autotrophes réalisées sur CO2/H2/O2 présentent un risque en termes de sécurité, car le mélange gazeux H2/O2, à des ratios supérieurs à 4 et 6 mol% respectivement, peut réagir pour former de l'eau dans une réaction hautement exergonique qui présente un risque explosif. Pour résoudre ce problème, il a été décidé de transférer l’H2 dans le milieu de culture à travers un contacteur membranaire, dispositif qui permet à une phase liquide d'entrer en contact avec une phase gazeuse sans se mélanger en utilisant la perméation à travers une membrane. Les membranes utilisées ici étaient des membranes à fibres creuses (HFM). L'hydrogène a été choisi comme gaz transféré à travers la membrane, tandis que les autres étaient apportés par bullage directement. Le choix a été fait car l’H2 est l'un des deux gaz concernés par le risque d'explosion, tout en étant beaucoup plus perméable que l'O2 à travers le polydiméthylsiloxane (PDMS), matériau composant les membranes étudiées ici. De plus, l'hydrogène est le plus cher des trois gaz, et ce système d'alimentation devrait limiter les pertes en H2. Ce système devrait permettre de maintenir un environnement gazeux pauvre en H2 éliminant tout risque d’explosion. Les résultats ont démontré que les contacteurs membranaires testés pouvaient fournir suffisamment d'hydrogène pour soutenir une croissance exponentielle du micro-organisme et sa production d'isopropanol, jusqu'à une concentration d'isopropanol de 1,38 g/L concomitante à une production d'acétone, co-produit de la synthèse d'isopropanol, de seulement 0,05 g/L. La concentration de biomasse, a atteint une valeur de 2,85 g/L. De plus, la concentration en hydrogène dans le ciel gazeux a été effectivement maintenue à des valeurs proches du seuil de sécurité par ce procédé. Ces résultats permettent de valider le concept initial. En comparaison, les cultures autotrophes réalisées dans le même bioréacteur mais sans contacteur membranaire, ont atteint une concentration d'isopropanol de 6,2 g/L, de biomasse de 9,9 g/L mais avec un taux d'hydrogène dans le ciel gazeux supérieure à 60 mol%. Le système membranaire a également été utilisé pour évaluer ses performances pour la seule croissance de C. necator, en utilisant une souche non productrice de PHB et permis d’atteindre une concentration finale de 10,1 g/L. Cette même souche a été utilisée dans cette étude pour caractériser une variété de systèmes de culture pour les cultures autotrophes. Ces systèmes comprenaient deux bioréacteurs gaz à TU Graz capables de fonctionner en toute sécurité dans des conditions potentiellement explosives et une série de bouteilles en verre Schott étanches à la pression, qui ont permis d'effectuer une optimisation des systèmes de culture autotrophes à petite échelle en termes de kLa, de concentration en oxygène dans le ciel gazeux et de rapport entre les volumes du milieu de culture et de ciel gazeux. |
Autotrophic cultivations are a promising way to couple greenhouse gases (GHG) utilization to value-added products production, by harnessing the potential of microorganisms capable of utilizing such gases as carbon sources. One example of such microorganisms is Cupriavidus necator, a Gram-negative bacterium capable of using CO2 as carbon source, O2 as electron acceptor and H2 as source of reducing power. C. necator naturally produces polyhydrohybutyrate (PHB) as a carbon storage molecule, and it has been widely studied and engineered to divert the carbon flow normally used for PHB to other products, such as isopropanol. Isopropanol is a chemical largely used in commerce as a detergent and as an additive in cosmetics, which was used in this study as the model value-added compound not only for its commercial interest but also for the short metabolic pathway that would have led to its production from intermediates already available in C. necator and its toxicity towards the strain, which allowed to also evaluate the impact of a product’s toxicity on C. necator. Autotrophic cultivations performed using CO2, O2 and H2 pose a safety risk, in that the gaseous mixture of hydrogen and oxygen, at concentrations greater than 4 mol% and 6 mol% respectively, can react to form water in a highly exergonic reaction that poses an explosion risk. To tackle this issue, in this study hydrogen was fed to the cultivation medium through a membrane contactor, a device that allows a liquid phase to contact a gaseous one without mixing, using permeation through a membrane. The membranes used in this study were hollow fiber membranes (HFMs), microscopic membrane fibers inside of which the gases could flow, permeating outwards into the liquid phase surrounding them in the contactor. Hydrogen was chosen as the gas to be fed through the membrane, while the others were bubbled directly in the medium. The choice was made because H2 is one of the two gases interested by the explosion risk, while also being much more permeable than O2 through polydimethylsiloxane (PDMS), the material of which the membranes were made. Furthermore, hydrogen is the most expensive of the three gases, and this feeding system is supposed to also increase feeding efficiency. The membrane contactors were able to supply enough hydrogen to sustain the growth of the microorganism and its isopropanol production, up to an isopropanol concentration of 1.38 g/L. The biomass concentration, in the optimal production conditions, reached a value of 2.85 g/L, showing a good production efficiency, reinforced by the final concentration of acetone, the main by-product of isopropanol production, of only 0.05 g/L. Furthermore, the hydrogen concentration in the headspace was kept at values close to the safety threshold by the action of the membrane, proving its effectiveness. In comparison, autotrophic cultivations performed in the same bioreactor but without the membrane contactor, reached an isopropanol concentration of 6.2 g/L and a biomass concentration of 9.9 g/L, but with a gaseous hydrogen concentration in the headspace higher than 60 mol% for most of the cultivation. The membrane system was also used to evaluate its performances in sustaining only the growth of C. necator, using a strain engineered to be unable to produce PHB without adding any other production pathway. Such strain, with hydrogen only supplied by a membrane contactor, reached a final concentration of 10.1 g/L. That same strain was used in this study to characterise a variety of cultivation systems for autotrophic cultivations. Such systems included two autotrophic bioreactors capable to safely operate under potentially explosive conditions and a series of pressure-tight Schott Glass Bottles to perform small-scale autotrophic cultivations, which were optimized in term of kLa, oxygen concentration in the headspace and ratio between cultivation medium’s and headspace’s volumes. |