La cristallisation est essentielle en pharmacie, agroalimentaire et science des matériaux. La cristallisation des protéines joue un rôle clé dans la compréhension des maladies dégénératives, la purification pharmaceutique et la biologie structurale, où la qualité des cristaux conditionne la détermination des structures atomiques par diffraction des rayons X.
Malgré son importance, la nucléation – première étape du processus – reste mal comprise en raison de son caractère stochastique et de la fugacité des phénomènes impliqués. La théorie classique, basée sur l’assemblage direct de monomères en noyaux, ne suffit pas à expliquer les mécanismes impliquant des phases intermédiaires comme la séparation de phase liquide-liquide (LLPS).
Cette thèse explore la nucléation des protéines à différentes échelles à l’aide de la microscopie FLIM et d’outils microfluidiques. D’abord, une approche utilisant la FLIM et le rotor moléculaire Sulforhodamine-B (SRB) est présentée pour caractériser les interactions protéine-protéine. Ces interactions influencent le diagramme de phase, déterminant ainsi les transitions de phase. Les expériences sur le lysozyme et l’albumine de sérum bovin (BSA) montrent que la durée de vie de fluorescence du SRB est un indicateur fiable de la transition entre interactions répulsives et attractives, permettant de prédire la solubilité des protéines et d’optimiser les conditions de cristallisation.
Ensuite, les cinétiques de nucléation du lysozyme ont été mesurées sur une large gamme de sursaturations à l’aide d’un dispositif microfluidique contrôlé en température. Chaque gouttelette servant de réacteur indépendant, cette approche a permis d’obtenir des statistiques fiables sur la nucléation. Les résultats révèlent une rupture dans le mécanisme de formation des cristaux : les fréquences de nucléation et le nombre de cristaux par gouttelette suivent des tendances distinctes selon que l’on se trouve proche de l’équilibre thermodynamique ou de la LLPS. Aucun résultat n’est en accord avec la description classique de la nucléation. Les données suggèrent que la nucléation est favorisée par des amas moléculaires de lysozyme dont la taille augmente en s’approchant de la courbe binodale, hypothèse corroborée par la littérature et des mesures de distribution de tailles obtenues par DLS.
Enfin, la combinaison de la FLIM et des outils microfluidiques permet d’étudier la nucléation cristalline en présence de LLPS. L’imagerie FLIM révèle les premières étapes de croissance des cristaux à l'intérieur ou en contact avec des gouttelettes de liquides denses. À sursaturation constante, les fréquences de nucléation montrent que la nucléation est plus lente dans les systèmes présentant une LLPS que dans des solutions homogènes. Ces résultats suggèrent que la nucléation se produit préférentiellement à l'intérieur des gouttelettes, en accord avec un modèle de nucléation non classique en deux étapes.
En intégrant FLIM et microfluidique, cette thèse valide une approche expérimentale innovante pour l’étude des transitions de phase des protéines et apporte de nouvelles perspectives sur leurs mécanismes de nucléation. |
Crystallization plays a vital role in various fields such as pharmaceuticals, food production, and materials science. Protein crystallization, in particular, is crucial for understanding degenerative diseases, purifying proteins in pharmaceutical processes, and enabling structural biology studies, where high-quality crystals are necessary for determining atomic structures using X-ray diffraction. Despite its importance, the initial step—nucleation—remains poorly understood due to its stochastic nature and molecular-scale dynamics. Classical Nucleation Theory describes nucleation through the direct assembly of monomers into nuclei via density fluctuations, but this model often fails to account for the complexity of nucleation, especially when mediated by intermediate phases like liquid-liquid phase separation (LLPS).
This thesis investigates protein nucleation mechanisms across various scales, from intermolecular interactions to macroscopic phase transitions, using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) with molecular rotors—fluorescent probes sensitive to environmental changes—and microfluidic tools. A novel approach is introduced using FLIM with the molecular rotor Sulforhodamine-B (SRB) to characterize protein-protein interactions. The balance between attractive and repulsive interactions between macromolecules shapes their phase diagram. Experimental results in lysozyme and Bovine Serum Albumin (BSA) solutions show that SRB fluorescence lifetime correlates with the transition from repulsive to attractive protein interactions near the solubility point, enabling accurate solubility predictions. This method offers a powerful tool for studying protein intermolecular interactions without large-scale equipment, facilitating the optimization of crystallization conditions.
Next, we explore nucleation kinetics in lysozyme protein solutions under varying conditions across the protein phase diagram, examining scenarios from thermodynamic equilibrium to the liquid-liquid phase separation boundary (binodal). Nucleation is inherently stochastic, requiring numerous experiments for accurate measurement. Using a temperature-controlled microfluidic chip, we trap independent droplets for statistical analysis. The results, analyzed within the Classical Nucleation Theory (CNT) framework, show a rupture in the nucleation mechanism at low temperatures near the binodal. This is evidenced by a nonlinear increase in nucleation rates and a higher number of crystals forming in each droplet, suggesting nucleation is facilitated by cluster formation—a hypothesis supported by existing literature and preliminary Dynamic Light Scattering (DLS) measurements.
Finally, we combine FLIM and microfluidic kinetics to examine the nucleation mechanism in systems undergoing LLPS. FLIM imaging tracks early-stage crystal growth within or near dense liquid droplets, revealing that nucleation in LLPS systems occurs more slowly than in homogeneous solutions, with longer induction times. These findings suggest that crystal nucleation primarily happens within dense liquid droplets rather than the bulk solution, supporting a non-classical two-step nucleation model.
By integrating FLIM and microfluidic techniques, this thesis provides new insights into protein phase transitions and nucleation mechanisms, advancing our understanding of the role of LLPS in crystallization. |