Les cellules souches/stromales adipeuses (ASCs) appartiennent à la famille des cellules stromales mésenchymateuses, reconnues pour leur potentiel de régénération. Leur migration du tissu adipeux vers d'autres organes a été observée en réponse à divers stress inflammatoires, lésionnels ou métaboliques. En particulier, il a été montré qu'un régime alimentaire riche en graisses déclenche la libération des ASCs du tissu adipeux, conduisant à la formation d'adipocytes ectopiques (par exemple dans le muscle squelettique ou les dépôts adipeux viscéraux) connus pour favoriser le développement du diabète de type 2. Ainsi, il pourrait exister un lien entre la concentration des ASCs circulantes et le risque de diabète de type 2. Cependant, l'isolement et la caractérisation des ASCs dans la circulation, considérées comme un événement rare, représentent encore un défi majeur.
Les techniques disponibles, y compris les essais à haute sensibilité et la cytométrie en flux, ont des limites. Elles ne permettent pas de détecter les ASCs présentes en faible quantité dans le sang (dizaines à centaines de cellules par millilitre) ou nécessitent un prétraitement des échantillons sanguins, pouvant entraîner des pertes, des dommages ou des modifications irréversibles de l'état moléculaire de ces cellules rares. Cette thèse vise à développer un dispositif innovant pour le tri des ASCs circulantes, baptisé "ASC-Finder", qui repose sur une sélection négative en deux étapes utilisant deux modules microfluidiques complémentaires.
La première partie de cette thèse a été consacrée au développement et à l'évaluation d’un module de filtration hydrodynamique (HDF) permettant la séparation par taille des cellules issues du sang total des donneurs. En utilisant cette approche sans marqueurs, nous avons pu injecter directement du sang total dans notre puce sans risque de colmatage et sans étapes de lyse ou de dilution préalables. Le module HDF a montré d'excellents taux de déplétion des érythrocytes atteignant 99,96 %, éliminant ainsi le principal obstacle à la détection des ASCs, sans impact sur l'intégrité cellulaire. Le module de HDF a été testé a été testé avec des ASCs fluorescentes ajoutées en très faible concentration à des échantillons de sang, et nous avons démontré une récupération totale des ASCs d'origine. Les ASCs isolées par HDF ont ensuite été testées dans des essais d'expansion et de différenciation, montrant une capacité de prolifération et de différenciation identique aux groupes témoins d’ASCs non filtrées, validant ainsi la compatibilité du dispositif avec ces cellules primaires fragiles.
Le deuxième module du dispositif ASC-Finder consistait en une puce de déplétion des leucocytes. Ce module visait à éliminer les leucocytes restants dans le rétentat généré par le premier module HDF. Il s’agit d’une puce classique de magnétophorèse Y-Y qui dévie les leucocytes marqués par des billes magnétiques recouvertes d'anticorps.
En utilisant le dispositif complet ASC-Finder, nous avons pu obtenir des taux de récupération élevés des ASCs à partir d'échantillons de sang total (> 81 %), permettant la détection et l'isolement de ces cellules rares (< 100 ASC/mL de sang) sans dommage, ainsi qu'une perte minimale due à la manipulation des échantillons. Le dispositif proposé rivalise avec des dispositifs commerciaux, offrant une étape cruciale vers la caractérisation et l'investigation du rôle des ASCs circulantes dans le sang. |
Adipose-derived stem/stromal cells (ASCs) belong to the mesenchymal stromal cell family, renowned for their regenerative potential. Their migration from adipose tissue to other organs has been observed in response to various inflammatory, injury-related, or metabolic stresses. Notably, a high-fat diet has been shown to trigger the release of ASCs from adipose tissue, leading to the formation of ectopic adipocytes (e.g., in skeletal muscle or visceral fat deposits), which are known to contribute to the development of type 2 diabetes. This suggests a potential link between circulating ASC levels and the risk of type 2 diabetes. However, the isolation and characterization of circulating ASCs, which are considered a rare event, remain a significant challenge.
Current techniques, including high-sensitivity assays and flow cytometry, have limitations. They struggle to detect the low abundance of ASCs in blood (tens to hundreds of cells per milliliter) or require pre-treatment of blood samples, which can cause cell loss, damage, or irreversible modifications to the molecular state of these rare cells. This thesis aims to develop an innovative device for sorting circulating ASCs, called the "ASC-Finder," based on a two-step negative selection process utilizing two complementary microfluidic modules.
The first part of this PhD was dedicated to the development and assessment of the hydrodynamic filtration (HDF) module that was employed for size-based separation of donors’ whole blood. Using this label-free approach, we were capable of directly injecting whole blood into our chip with no risk of clogging, without the need for lysis or dilution. The HDF module exhibited excellent erythrocyte depletion rates reaching 99.96 % therefore clearing the major obstacle in ASC detection with no impact on cell integrity. The HDF unit was tested with fluorescent ASCs spiked in blood and yielded total recovery of the original ASCs. The HDF-isolated ASCs were later tested in expansion and differentiation assays and showed identical proliferation and differentiation capacity compared to control groups of ASCs in cell culture media, thereby validating the safety of the device on the fragile primary cells.
The second unit of the ASC-Finder device consisted of a leukocyte depletion chip. This module aimed to further purify the ASCs by depleting the remaining leukocytes present in the retentate generated by the first HDF module. We choose to develop a classic Y-Y magnetophoresis chip that deviates leukocytes by the means of antibody coated magnetic beads..
Using the ASC-Finder device we were able to obtain high ASC recovery rates from whole blood samples (> 81 %) enabling detection and isolation of these rare-cells (< 100 ASC/mL of blood) without any damage due to lysis and centrifugation as well as minimal loss due to sample handling. The proposed device competes with commercial devices offering a crucial step towards characterizing and investigating the role of blood-circulating ASCs. |