Les mammifères hébergent des communautés microbiennes très diverses. Parmi celles-ci, le microbiote intestinal joue un rôle crucial dans la santé de l’hôte. Les bactéries intestinales utilisent des polysaccharides et oligosaccharides variés comme principales sources de carbone, en utilisant des systèmes protéiques complexes pour dégrader ces substrats en monosaccharides assimilables. Les bactéries du phylum Bacteroidota sont parmi les plus abondantes dans les microbiomes intestinaux des mammifères. Elles produisent une série de protéines nécessaires à la détection, à la capture, au transport et à la dégradation des polysaccharides et oligosaccharides. Ces systèmes complexes sont codés par des loci dédiés à l'utilisation des polysaccharides (PUL). A la surface cellulaire, les protéines de liaison aux glycanes (SGBPs) jouent un rôle majeur dans l’efficacité de capture des polysaccharides et des oligosaccharides entourant les cellules, offrant ainsi aux Bacteroidota un avantage compétitif dans la colonisation de leurs habitats. . Dans ce travail de thèse, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation et l'ingénierie des transporteurs de bactéries du phylum Bacteroidota, en particulier leurs composants SGBPs, isses des microbiomes digestifs humains et bovins. L'objectif était d'élucider les relations structure-fonction des différents éléments protéiques de ces transporteurs impliqués dans l'utilisation des polysaccharides d’origine alimentaire ou microbiennne. Nous avons tout d’abord caractérisé la fonction et la structure cristallographique d’une protéine de type SusD (appelée ici F5_SusD-like) codée par un PUL provenant d’un Bacteroides non cultivé de l’intestin humain, et qui est conservé chez Bacteroides vulgatus, une espèce dominante dans le microbiote intestinal. Malgré son incapacité à se lier aux xylooligosaccharides (XOS), qui sont pourtant les substrats ciblés par le F5_PUL, F5_SusD est essentiel à la fonctionnalité du transport. L'analyse structurale a révélé des boucles désordonnées et des résidus clés mal alignés, qui pourraient être responsables de l'incapacité de cette protéine de type SGBP à se lier aux XOS. Dans un second temps, nous avons étudié la spécificité des transporteurs F5_SusC/D et F5_MFS vis-à-vis des XOS en introduisant une β-mannosidase dans le périplasme des souches recombinantes d’E. coli produisant ces transporteurs. En utilisant des variants du locus F5 précédemment construits par Tauzin et al., nous avons complété le système d'utilisation des oligosaccharides de F5 avec l'enzyme BT_0458 de la famille CAZy GH2. Nos données préliminaires suggèrent que les transporteurs du clone métagénomique F5 ne peuvent pas internaliser le mannotriose, indiquant une probable stricte spécificité de ces systèmes vis-à-vis des XOS. Par la suite, nous avons exploré le potentiel de l’évolution adaptative en laboratoire (ALE) pour l’ingénierie du système recombinant d’utilisation des XOS chez E. coli. Cette étude préliminaire indique que l’évolution in cellulo pourrait servir à améliorer les fonctions de transporteurs recombinants chez E. coli et à approfondir l’étude de leurs relations structure-fonction sous pression évolutive. Enfin, nous avons caractérisé une autre protéine de type SusD (appelée 41O1_SusD) codée par un locus d'utilisation de β-glucanes et provenant d'un clone métagénomique isolé du microbiome du rumen bovin. La caractérisation fonctionnelle de cette protéine a montré que 41O1_SusD présente une affinité de liaison pour les β-1,3-glucanes ramifiés par des liaisons β-1,6. Une comparaison structurale avec des protéines homologues a permis de mettre en évidence des motifs similaires de reconnaissance du substrat, impliquant trois résidus tryptophane. Ces résultats ont permis de progresser dans la compréhension du rôle joué par les protéines de type SusD dans l’utilisation des substrats issus de la paroi cellulaire végétale et/ou d’origine fongique dans le rumen bovin. |
Mammals host very diverse microbial communities. Among these, the gut microbiota plays a crucial role in host health. Gut bacteria utilize various polysaccharides and oligosaccharides as carbon sources, using complex protein machineries to degrade these substrates into assimilable monosaccharides. Bacteroidota represents one of the dominant phyla in mammal gut microbiomes. They produce a series of proteins necessary for the sensing, capture, transport and degradation of polysaccharides and oligosaccharides. These complex machineries are encoded by polysaccharide utilization loci (PULs). Among the proteins encoded by PULs, cell surface glycan-binding proteins (SGBPs) are essential for the efficient capture of substrates surrounding the cells. In this thesis work, we focused on the characterization and engineering of Bacteroidota transporters, in particular their SGBP components, identified from the human and bovine gut microbiomes. The aim was to elucidate the structure-function relationships of the different protein elements of these transporters, involved in the utilization of dietary or microbial glycans in gut microbiomes. We first characterized the function and crystallographic structure of a SusD-like protein (referred to F5_SusD-like here) encoded by a xylooligosaccharide (XOS) PUL from an uncultured human gut Bacteroides species, which is conserved in the prominent Bacteroides vulgatus species. Despite its inability to bind to XOS, that are the cognate substrates of the F5_PUL, the F5_SusD-like protein is essential for the uptake functionality. Structural analysis revealed disordered loops and misaligned key residues, which could be responsible for the inability of this SGBP-like protein to bind XOS. Then, we investigated the specificity of F5_SusC/D and F5_MFS transporters towards XOS by introducing aβ-mannosidase into the periplasm of the recombinant E. coli strains harboring these transporters. This approach aimed at determining if the transporters could uptake mannotriose, which would be degraded to monosaccharides by the β-mannosidase and support E. coli growth. Using F5 variants previously constructed by Tauzin et al., we complemented the F5 oligosaccharide utilization system with the BT_0458 β-mannosidase from the GH2 CAZy family. Our preliminary data suggest that the F5 transporters cannot recognize and transport mannotriose, indicating a probable strict specificity towards XOS. Subsequently, we explored the potential of adaptive laboratory evolution (ALE) to engineer the recombinant F5_XOS utilization pathway in E. coli. After serial sub-cultures of the F5_XOS containing E. coli strains, the mutation rates and positions were assessed by next-generation sequencing. This preliminary study indicated that ALE could serve to improve transporter functions and provided the basis for further investigation of the structure-function relationships of oligosaccharide transporters under evolutionary pressures. Finally, we characterized another SusD-like protein (referred to 41O1_SusD) encoded by a β-glucan utilization locus from a metagenomic clone isolated from the bovine rumen microbiome. Functional characterization showed that the 41O1_SusD-like protein exhibits binding affinity for β-1,6 branched β-1,3-glucans. Structural comparison with homolog SusD-like proteins highlighted a similar pattern of substrate recognition, involving three tryptophan residues. Our findings provided advances in the understanding of the role played by SusD-like proteins in plant cell wall and/or fungal polysaccharide utilization in the cow rumen. Overall, this thesis generated advances in the understanding of the structure-function relationships of SusD-like proteins. In the long term, the findings will contribute to the development of potential applications in synthetic biology and microbial engineering for enhanced polysaccharide utilization. |