L’activation des lymphocytes T (LT) repose sur la reconnaissance d'antigènes spécifiques via l'interaction du TCR avec les complexes peptide-CMH. Elucider les mécanismes moléculaires qui régulent le niveau et la qualité d'activation des LT est primordial pour comprendre les réponses physiologiques et pathologiques médiées par les LT. Au cours de ma thèse, j'ai choisi d'aborder cette question sous les angles complémentaires de la modulation proximale de la signalisation du TCR via la kinase LCK et de la modulation de l'activation du TCR via l'engagement complémentaire des récepteurs de costimulation (CoStimR). Directement en aval du TCR, LCK est connu pour enclencher les voies de signalisation nécessaires au développement thymique et l’acquisition des fonctions effectrices des LT. L’effet d’une modulation de l’activité de LCK sur le développement et l’activation des LT humains et murins est mal connu. J’ai eu l'opportunité d'explorer l'impact moléculaire et fonctionnel d'un variant de LCK (p.F498del) identifié chez 2 enfants présentant une lymphopénie T CD8+ sévère. La modélisation in silico suggère que le variant F498del entraîne l’activation constitutive de LCK en diminuant son interaction avec la kinase CSK, qui inhibe normalement l’activité catalytique de LCK. La signalisation du TCR est augmentée dans les cellules primaires des patients, alors que l’expression des co-récepteurs CD4 et CD8 est diminuée. Malgré ces altérations moléculaires, la prolifération, l’apoptose, la production de cytokines et la cytotoxicité, évaluées in vitro dans les LT primaires, ne montrent pas d’anomalies majeures. La construction et l'analyse d'un modèle murin portant le variant F498del ont permis de mettre en évidence une anomalie de développement thymique au stade double négatif (CD4-CD8-) et une diminution du pourcentage de thymocytes simples positifs (CD4+ et CD8+). En conclusion, le variant F498del cause une lymphopénie d’origine centrale associée à une hyperactivation de la signalisation proximale du TCR, sans répercussion clinique à ce jour. Outre le TCR, les LT expriment de nombreux CoStimR qui modulent l’acquisition des fonctions effectrices et mémoires. Il n’existe pas d’étude comparative à large échelle de l’effet des CoStimR lors de la primo-activation des LT CD8 humains. J’ai comparé de manière systématique les effets co-stimulateurs des récepteurs CD28, ICOS, CD226, CD2, LFA1, CD27, OX40 ou GITR sur l’activation des LT CD8+ naïfs humains. Ces récepteurs se distinguent de par leur capacité à stimuler la prolifération et l’acquisition de molécules lytiques, deux paramètres fortement associés. Par ailleurs, ces CoStimR modulent distinctement la sécrétion d’IFNγ, de TNFα et d’IL-2 ; sans lien direct avec leur profil d’expression ou leur capacité de stimulation de la prolifération. L’analyse du protéome des LT CD8+ stimulés montre que la capacité co-stimulatrice des récepteurs sur la prolifération est corrélée aux nombres de protéines différentiellement exprimées. Néanmoins, à prolifération équivalente, chaque CoStimR module l’expression de protéines spécifiques, parfois non modifiées par l’activation du TCR. En particulier, j'ai mis en évidence l'impact de l'engagement d'ICOS sur l'induction sélective de CD103/ITGAE et sur sa propension à induire un programme de différentiation en LT résidents mémoires. Notre étude comparative permet donc de hiérarchiser les CoStimR selon leur capacité à moduler quantitativement et qualitativement la primo-stimulation des LT CD8+ humains. Ce travail met en évidence que la modulation fine d’acteurs de la signalisation des LT (LCK et CoStimR) impacte leur développement, leur sensibilité à l’activation et l’acquisition de fonctions effectrices différentes. Outre l'impact direct de l'étude pour le suivi des patients mutés pour LCK, il est envisageable que les connaissances générées puissent être mises à profit pour l'optimisation d’approches thérapeutiques ciblant les LT, en particulier les cellules CAR-T. |
Activation of T cells relies on the recognition of specific antigens through the interaction of the TCR with peptide-MHC complexes. Elucidating the molecular mechanisms that regulate the level and quality of T cell activation is crucial for understanding the physiological and pathological responses mediated by T cells. In my thesis, I chose to address this question from the complementary angles of proximal modulation of TCR signaling via the LCK kinase and modulation of TCR activation through the complementary engagement of costimulation receptors (CoStimR). Directly downstream of the TCR, LCK is known to initiate the signaling pathways necessary for thymic development and the acquisition of effector functions in T cells. The effect of modulating LCK activity on the development and activation of human and murine T cells is poorly understood. I had the opportunity to explore the molecular and functional impact of a variant of LCK (p.F498del) identified in two children presenting with severe CD8+ T lymphopenia. In silico modeling suggests that the F498del variant leads to constitutive activation of LCK by decreasing its interaction with the CSK kinase, which normally inhibits LCK's catalytic activity. TCR signaling is enhanced in the patients' primary cells, while CD4 and CD8 co-receptor expression is reduced. Despite these molecular alterations, proliferation, apoptosis, cytokine production, and cytotoxicity, assessed in vitro in primary T cells, did not show significant abnormalities. The construction and analysis of a murine model carrying the F498del variant revealed a thymic development anomaly at the double-negative (CD4-CD8-) stage and a decrease in the percentage of single-positive thymocytes (CD4+ and CD8+). The F498del variant is responsible for lymphopenia of central origin caused by hyperactivation of proximal TCR signaling, with no clinical repercussions to date. Beyond the TCR, T cells express numerous CoStimR that modulate the acquisition of effector and memory functions. There is no large-scale comparative study of the effect of CoStimR during the primary activation of human CD8+ T cells. I systematically compared the co-stimulatory effects of CD28, ICOS, CD226, CD2, LFA1, CD27, OX40, or GITR receptors on the activation of naïve human CD8+ T cells. These receptors differ in their ability to stimulate proliferation and the acquisition of lytic molecules, two strongly associated parameters. Additionally, these CoStimR distinctly modulate the secretion of IFNγ, TNFα, and IL-2, with no direct link to their expression profile or their capacity to stimulate proliferation. Proteomic analysis of stimulated CD8+ T cells shows that the co-stimulatory capacity of the receptors on proliferation correlates with the number of differentially expressed proteins. However, even in cases of comparable impact on proliferation, each CoStimR modulates the expression of specific proteins, sometimes not altered by TCR activation. In particular, I focused on the impact of ICOS engagement on the selective induction of CD103/ITGAE and its propensity to induce a differentiation program toward resident memory T cells. Our comparative study thus allows for the ranking of CoStimR according to their capacity to quantitatively and qualitatively modulate the primary stimulation of human CD8+ T cells. This work highlights that fine-tuning of T cell signaling components (LCK and CoStimR) impacts their development, sensitivity to activation, and the acquisition of different effector functions. Beyond the direct impact of this study for monitoring patients with LCK mutations, the generated knowledge could potentially be leveraged to optimize therapeutic approaches targeting T cells, particularly CAR-T cells. |