Chez le porcelet, des diarrhées sont couramment observées après le sevrage et sont associées à une dysfonction de la barrière épithéliale intestinale. Dans le contexte de la réduction de l’utilisation des antibiotiques en élevage, de nouvelles stratégies sont mises en place pour préserver la santé digestive des porcelets lors du sevrage. Parmi celles-ci, l’utilisation de postbiotiques (produits nutritionnels dérivés de micro-organismes) semble être une stratégie prometteuse mais leurs effets sur l’épithélium intestinal du porcelet sont peu connus. Ce travail de thèse avait pour objectif de développer et caractériser un modèle de culture d’organoïdes d’intestin de porcelets permettant de tester les effets de postbiotiques ciblant la fonction de barrière de l’épithélium intestinal. La mise en culture de cellules souches épithéliales intestinales de porcelets dans un gel de protéines de matrice extracellulaire nous a permis d’obtenir des structures tridimensionnelles (3D) formées d’une monocouche de cellules épithéliales polarisées et comprenant plusieurs types cellulaires. Nous avons constitué une biobanque d’organoïdes 3D de jéjunum et de côlon de porcelets allaités ou sevrés (n = 12 par condition). Nous avons également mis au point une méthode permettant de cultiver des organoïdes d’intestin de porcelets à partir de cryptes épithéliales cryoconservées. Sur la base de l’analyse de l’expression de 89 gènes, nous avons montré que les organoïdes d’intestin de porcelets conservaient en partie le phénotype lié à leur segment digestif d’origine alors qu’ils ne maintenaient pas le profil d’expression de gènes spécifique des porcelets allaités ou sevrés. Nos analyses de microbiote et de métabolome de l’intestin des porcelets à l’origine des organoïdes suggèrent que reproduire plus fidèlement l'environnement luminal pourrait contribuer à améliorer la pertinence physiologique des organoïdes. Notre caractérisation des organoïdes cultivés en 3D a confirmé que le pôle apical des cellules épithéliales est orienté vers leur lumière et n’est donc pas facilement accessible pour étudier les effets de produits nutritionnels. Nous avons alors mis au point un modèle de culture de monocouches de cellules d’organoïdes permettant d’avoir accès au pôle apical des cellules et d’étudier la fonction de barrière de l’épithélium. Grâce à ce modèle, nous avons testé les effets de trois produits dérivés de micro-organismes : le butyrate, un métabolite produit par le microbiote intestinal et deux postbiotiques, l’un dérivé de levures (YANG) et l’autre dérivé de bactéries (Lactobacillus helveticus). Nous avons montré que le butyrate régulait l’équilibre prolifération/différentiation cellulaire, renforçait la barrière épithéliale et modulait l’expression de gènes impliqués dans les réponses immunitaires innées alors que les effets des postbiotiques YANG et L. helveticus étaient nettement moins marqués. Ces effets dépendaient fortement des conditions de culture mimant ou non la niche des cellules souches. Nous avons également étudié ces produits dérivés de micro-organismes dans le contexte d’une dysfonction de la barrière épithéliale induite par la mycotoxine déoxynivalénol (DON). Le YANG et L. helveticus n’ont pas prévenu les effets du DON alors que le butyrate a réduit ou amplifié certains de ses effets. L’ensemble de nos résultats indiquent que le modèle des organoïdes intestinaux de porcelet est utile pour étudier la physiologie de l'épithélium intestinal d'une manière spécifique aux segments intestinaux. Les monocouches de cellules d’organoïdes d’intestin de porcelet permettant l’accès au pôle apical des cellules peuvent être utilisées pour mettre en évidence les effets de produits dérivés de micro-organismes sur la barrière épithéliale. Ces nouveaux outils pourront être utilisés dans de nombreux contextes pour étudier in vitro l’épithélium digestif porcin pour la recherche vétérinaire et biomédicale. |
In piglets, diarrhea is commonly observed after weaning and is associated with a dysfunction of the intestinal epithelial barrier. In the context of the reduction of antibiotics use in farms, new strategies are implemented to preserve the digestive health of piglets at weaning. The use of postbiotics (nutritional products derived from microorganisms) seems to be a promising strategy but their effects on the piglet intestinal epithelium are not well known. The objective of this thesis was to develop and characterize a model of piglet intestinal organoids allowing to test the effects of postbiotics targeting the barrier function of the intestinal epithelium. By culturing piglet intestinal epithelial stem cells in an extracellular matrix protein gel, we were able to obtain three-dimensional (3D) structures formed by a monolayer of polarized epithelial cells and including several cell types. We have built a biobank of 3D organoids from the jejunum and colon of suckling and weaned piglets (n = 12 per group). We have also developed a method to grow piglet intestinal organoids from cryopreserved epithelial crypts. Based on the expression analysis of 89 genes, we showed that piglet intestinal organoids partially retained the phenotype related to their original digestive segment while they did not maintain the specific gene expression profile of suckling or weaned piglets. Our analyses of the microbiota and metabolome of the piglet intestine from which the organoids originated suggest that more closely mimicking the luminal environment could help improve the physiological relevance of the organoids. Our characterization of 3D organoids confirmed that the apical side of epithelial cells is oriented towards the lumen and is therefore not easily accessible to study the effects of nutritional products. We then developed an organoid cell monolayer culture model that allows access to the apical side of the cells and to study the barrier function of the epithelium. Using this model, we tested the effects of three products derived from microorganisms: butyrate, a metabolite produced by the intestinal microbiota, and two postbiotics, one derived from yeast (YANG) and the other from bacteria (Lactobacillus helveticus). We showed that butyrate regulated the cell proliferation/differentiation balance, strengthened the epithelial barrier and modulated the expression of genes involved in innate immune responses, whereas the effects of the postbiotics YANG and L. helveticus were much less marked. These effects were highly dependent on the culture conditions mimicking or not the stem cell niche. We also studied these microorganism-derived products in the context of epithelial barrier dysfunction induced by the mycotoxin deoxynivalenol (DON). YANG and L. helveticus did not prevent the effects of DON while butyrate reduced or amplified some of its effects. Taken together, our results indicate that the piglet intestinal organoid model is useful for studying the physiology of the intestinal epithelium in a gut segment-specific manner. Cell monolayers derived from piglet intestinal organoids allow access to the apical side of the cells and can be used to demonstrate the effects of microorganism-derived products on the epithelial barrier. These new tools can be used in many contexts to study in vitro the porcine digestive epithelium for veterinary and biomedical research. |