Le bioprocédé consolidé (CBP) est la conversion directe de la lignocellulose en produits chimiques de commodité par un micro-organisme ou un consortium de micro-organismes. Il constitue donc une alternative intéressante aux procédés pétrochimiques traditionnels. Clostridium acetobutylicum ATCC 824 est une bactérie prometteuse pour le CBP car elle a été précédemment utilisée pour produire industriellement du butanol, de l’éthanol et de l’acétone (ABE) ; et car elle possède tous les gènes nécessaires pour produire un cellulosome fonctionnel. Le cellulosome est un complexe multienzymatique spécialisé dans la dégradation de la cellulose, toutefois C. acetobutylicum ATCC 824 est incapable de croître sur des substrats lignocellulosiques.
L’objectif principal de cette thèse est de construire une souche de C. acetobutylicum capable de se développer sur de la lignocellulose prétraitée, et d’ainsi convertir directement la matière lignocellulosique en butanol ou en d’autres produits chimiques de commodité. La modification du génome de C. acetobutylicum a été réalisée à l’aide d’un système CRISPR-Cas9 inductible développé durant la thèse.
Dans un premier temps, les raisons de l’incapacité de C. acetobutylicum à hydrolyser les matières lignocellulosiques ont été étudiées. Pour cela, les trois enzymes cellulosomiques principales de C. acetobutylicum ont été caractérisées : Cel48A, Cel9X et Cel5Y.
Une grande partie de la thèse s’est orientée vers la caractérisation de l’enzyme Cel48A, qui est codée par le deuxième gène de l'opéron cip-cel. Des recherches antérieures menées par notre équipe ont permis de purifier Cel48A à partir d'Escherichia coli. L'enzyme ainsi purifiée a été considérée comme inactive. Cependant, ces résultats étaient dus à des problèmes de solubilité de Cel48A lorsqu'elle est produite par E. coli, et ne reflétaient pas les véritables propriétés de Cel48A. Cel48A est en réalité active sur substrat cellulosique une fois purifiée à partir de C. acetobutylicum. Nous avons également montré que Cel48A pouvait être produite à des niveaux très élevés lorsque l’opéron cip-cel était surexprimé dans C. acetobutylicum. Une approche de mutagénèse dirigée a également été entreprise durant cette thèse afin de tenter d’améliorer l’activité cellulolytique de Cel48A. Cependant cette approche n’a pas réussi.
Une autre partie importante de la thèse s’est orientée sur la caractérisation de l’enzyme Cel5Y. Un homologue de cel5Y, engE, a été identifié dans le génome de Clostridium cellulovorans, et EngE a été reconnue comme responsable de l'ancrage du cellulosome à la paroi cellulaire. Pour ces raisons, nous avons émis l'hypothèse que Cel5Y pourrait être capable d'ancrer le cellulosome dans la paroi cellulaire. Nous avons d'abord montré que Cel5Y était une enzyme active en purifiant la protéine recombinante à partir d’E. coli. Ensuite, nous avons montré que Cel5Y pouvait être produite à des niveaux très élevés lorsque cel5Y était surexprimé. Nous avons ensuite montré que Cel5Y était capable de se fixer à la paroi cellulaire et était également capable d'y ancrer le cellulosome de C. acetobutylicum.
Les gènes codants pour les enzymes cellulosomiques étudiées durant cette thèse sont nativement exprimés à de très faibles niveaux chez C. acetobutylicum. Tous les gènes cellulosomiques ont alors été surexprimés dans une même souche en changeant les promoteurs natifs de l’opéron cip-cel, de cel5Y et de cel9X, par le promoteur constitutif fort du gène thlA. La souche finale est capable de dégrader et de métaboliser simultanément un substrat lignocellulosique à une vitesse similaire à celle des organismes cellulolytiques natifs. Une ingénierie plus poussée du métabolisme de C. acetobutylicum devrait permettre de produire des niveaux élevés de butanol et d’éthanol. Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse ont contribué de manière significative aux efforts d’ingénierie d’un organisme CBP industriellement viable. |
Consolidated bioprocessing (CBP) is the direct conversion of lignocellulose into bulk chemicals by a micro-organism or consortium of micro-organisms and is an attractive alternative to petrochemical processes. Clostridium acetobutylicum ATCC 824 is a promising candidate for CBP as it has been previously used industrially to produce butanol, acetone and ethanol (ABE), and has all the necessary genes to produce a functional cellulosome. The cellulosome is a multienzyme complex specialized in cellulose degradation, however, C. acetobutylicum ATCC 824 is unable to grow on lignocellulosic substrates.
The main objective of this thesis is to construct a strain of C. acetobutylicum capable of growing on pretreated lignocellulose and thus directly converting lignocellulosic material into butanol or other commodity chemicals. The modification of the C. acetobutylicum genome was performed using an inducible CRISPR-Cas9 system developed during the thesis.
First, the reason(s) for the inability of C. acetobutylicum to hydrolyze lignocellulosic materials were studied. For this purpose, the three main cellulosomal enzymes of C. acetobutylicum were characterized; Cel48A, Cel9X, and Cel5Y. The cellulosomal enzyme Cel5B, whose activity was previously unknown, was also characterized during this thesis.
A large part of this thesis was directed towards the characterization of the Cel48A enzyme, this enzyme is encoded by the second gene of the cip-cel operon. Previous research by our team purified Cel48A from Escherichia coli and the purified enzyme was considered to be inactive, however, these results were caused by Cel48A insolubility issues when produced by E. coli, and did not reflect the true properties of Cel48A. Cel48A is in fact active on cellulose when purified from C. acetobutylicum. We also showed that Cel48A could be produced at very high levels when the cip-cel operon was overexpressed in C. acetobutylicum. A directed mutation approach was also undertaken during this thesis to try to improve the cellulolytic activity of Cel48A, however, this approach was not successful.
Regarding Cel9X, almost no activity could be measured when purified from E. coli, however, like Cel48A, Cel9X is active when purified from C. acetobutylicum. We also showed that Cel9X can be produced at high levels when cel9X was overexpressed in C. acetobutylicum.
Another important part of this thesis focused on the characterization of the Cel5Y enzyme. It is well known that cell wall-associated cellulosomes are widespread and play a crucial role in lignocellulose degradation. A cel5Y homolog, engE has been identified in the genome of Clostridium cellulovorans and EngE has been shown to be responsible for anchoring the cellulosome to the cell wall. For these reasons, we hypothesized that Cel5Y might be able to anchor the cellulosome to the cell wall. We first showed that Cel5Y is an active enzyme by purifying the recombinant protein from E. coli. Then, since cel5Y is natively expressed at low levels in C. acetobutylicum, we showed that Cel5Y could be produced at very high levels when cel5Y is overexpressed. We then showed that Cel5Y is able to bind to the cell wall and is also able to anchor the cellulosome of C. acetobutylicum to the cell wall.
The genes encoding the cellulosomal enzymes studied during this thesis are natively expressed at very low levels by C. acetobutylicum. All cellulosomal genes were then overexpressed in a single strain by changing the native promoters of the cip-cel operon, cel5Y, and cel9X to the strong constitutive thlA promoter. The final strain was able to simultaneously degrade and metabolize a lignocellulosic substrate at a similar rate to native cellulolytic organisms. Further engineering of the metabolism should enable C. acetobutylicum to produce high levels of butanol and ethanol. The work performed in this thesis contributed significantly to efforts to engineer an industrially viable CBP organism. |