L’organisation spatiale des enzymes est un domaine de l’ingénierie métabolique permettant d’améliorer les voies de biosynthèses. En effet, organiser les enzymes dans un même espace permet de limiter la perte d’intermédiaire vers des voies métaboliques adverse ou limiter leur toxicité dans la cellule. Parmi les stratégies permettant de rapprocher les enzymes entre elles, on distingue la compartimentalisation des enzymes, l’organisation des enzymes sur des scaffolds ou en métabolons, ou encore les protéines de fusion. Ces méthodes existent dans la nature et ont été adaptées à l’ingénierie métabolique. La fusion des enzymes est la méthode la plus directe pour rapprocher des enzymes mais leur conception reste empirique.
L’objectif principal de cette thèse était l’étude des paramètres du linker pouvant impacter les proteins de fusion. En partant d’une souche d’Escherischia coli optimisée pour la production de lycopène, une stratégie de fusion des enzymes lycopene cyclase (crtY) and β-carotene hydroxylase (crtZ) a été mise en place pour la production de zéaxanthine. Une banque de linker a été conçue puis clonée entre les enzymes pour en étudier les paramètres physico-chimique pouvant impacter la protéine de fusion crtY/crtZ.
En plus des paramètres couramment connus pour impacter les protéines de fusion tels que l’orientation des enzymes, la taille ou la flexibilité du linker, nous avons identifié un quatrième paramètre important. En effet, l’usage des acides aminés aux deux extrémités du linker est beaucoup plus polarisés que dans le reste du linker, avec quatre acides aminés sur-représentés. Nous avons pu vérifier que cette régle reste vraie dans une banque des 1280 linkers également.
La fusion des enzymes crtY et crtZ a permi d’obtenir des souches améliorées pour la production de zeéxanthin, que ce soit en termes de spécificité de production pour la zéaxanthine, ou en termes de quantité totale de caroténoïdes produits. |
Spatial organisation of enzyme is a field of metabolic engineering that enables the improvement of metabolic pathways. Indeed, clustering enzymes can limit the loss of intermediates towards competitive pathways or limit the toxicity of theses intermediates within the cell. Strategies such as enzyme compartmentalization, organising of enzymes on scaffold or in metabolon, and protein fusion can bring enzymes inclose proximity. Protein fusion is the most straighforward method to bring enzymes in close proximity but its design remains empirical.
The main objective of this thesis was to investigate the parameters of linkers that impact protein fusion. Starting from a strain of Escherichia coli optimized for the production of lycopene, a protein fusion strategy was implemented on the lycopene cyclase crtY and β-carotene hydroxylase crtZ to produce zeaxanthin. A linker library was designed and cloned between the enzymes to systematically asses the role of physicochemical parameters of the linkers in the crtY/crtZ protein.
In addition to the common parameters such as the enzymes orientation, the length and flexibility of the linker, a fourth parameter was identified. Indeed, the use of amino acid at the extremities of the linker was shown to be more polarized than in the rest of the linker, with four amino acids more represented. We were able to verify that this rule was also observed in the 1280 linkers of natural multidomain proteins.
The fusion of crtY and crtZ enzymes allowed to obtain strains improved for the production of zeaxanthin in terms of final titer or specificity. |