L’adhésion est cruciale pour la réponse cytotoxique du lymphocyte TCD8+, tant pour sa motilité, que pour le développement de la synapse immunologique qu’il construit avec une cellule présentatrice d’antigène. L’intégrine LFA-1 (Lymphocyte Function-associated Antigen 1), est un important médiateur de cette adhésion. En effet, elle peut adopter différentes conformations spatiales, chacune développant une affinité différente pour son ligand (et notamment ICAM-1, pour InterCellular Adhesion Molecule 1), ce qui permet au lymphocyte T de faire évoluer ses capacités adhésives en fonction de la situation. En particulier, il a été démontré dans la littérature que la stimulation du TCR (T Cell Receptor) peut déclencher l’activation des molécules de LFA-1 (haute affinité pour ICAM-1), qui sont alors observées sous forme de nanoclusters.
Dans cette thèse, mon premier objectif a été de mesurer l’effet de la stimulation TCR sur l’activation et l’organisation spatiale de LFA-1. Des approches de microscopie confocale et de cytométrie en flux ont démontrées une activation progressive de LFA-1 avec le degré de stimulation du TCR. Dans un second temps, j’ai étudié l’organisation spatiale de LFA-1 par microscopie STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy). La détection des clusters par « machine-learning » a révélé que la forme inactive de LFA-1 existe également sous forme de nanoclusters, répartis de manière homogène dans le plan d’adhésion du lymphocyte T, contrairement aux nanoclusters actifs qui se trouvent dans des endroits spécifiques : l’uropode dans le cas de la cellule en migration, ou bien organisés sous forme de ceinture dans le cas de la cellule formant une synapse immunologique. La caractérisation plus poussée de ces nanoclusters, et en particulier de leur taille et de leur composition, suggère qu’ils seraient des unités adhésives, capables de basculer d’un état conformationnel à un autre, en fonction du degré d’engagement du TCR.
Le second objectif de mes travaux a été de comprendre le lien entre activation de LFA-1, adhésion et cytotoxicité. Pour cela, j’ai utilisé la cytométrie en flux, qui a montré que l’activation de LFA-1 et la sécrétion des granules lytiques se déroulent à partir de différents seuils de stimulation du TCR. J’ai également développé une approche de microscopie « live » qui mesure les interactions ainsi que la destruction de cellules cibles (offrant différents niveaux de stimulation) par des lymphocytes TCD8+. Cela a montré que les cellules cibles exprimant moins de molécules stimulatrices du TCR ont de plus faibles probabilités d’être touchées et tuées par le lymphocyte T CD8+. J’ai aussi mesuré l’influence de l’ICAM-1 sur les processus d’activation de LFA-1, de l’adhésion qui en découle, ainsi que de la cytotoxicité. En effet, les données de la littérature suggèrent que la présence d’un ligand (ici, ICAM-1) est nécessaire pour l’activation de LFA-1. En réutilisant les méthodes précédentes, j’ai observé qu’une diminution de la disponibilité des molécules d’ICAM-1 mène à une baisse de l’activation de LFA-1, ce qui a eu un impact significatif sur l’adhésion du lymphocyte ainsi que sur ses capacités cytotoxiques.
Un autre aspect de ma thèse a été le développement d’un modèle mésoscopique numérique et physique, basé sur mes données expérimentales. J’ai modélisé une synapse immunologique, composée des membranes d’une cellule cible et d’un lymphocyte TCD8+. Les molécules de chaque membrane sont capables d’interagir, ce qui aboutit à l’émergence de motifs et de dynamiques observables dans de réelles synapses immunologiques.
En conclusion, ces travaux de thèse apportent de nouvelles connaissances sur le lien étroit entre la stimulation du TCR et l’activation de LFA-1 ainsi que son organisation spatiale. LFA-1 apparaît comme une molécule clef de la réponse cytotoxique, en mesure de moduler l’adhésion via son organisation en nanoclusters, capable de basculer d’un état conformationnel à un autre. |
Adhesion is crucial for the cytotoxic response of the CD8+ T cell, both for its motility and for the development of the immunological synapse that it builds with an antigen-presenting cell. The integrin LFA-1 (Lymphocyte Function-associated Antigen 1) is an important mediator of this adhesion. Indeed, it can adopt different spatial conformations, each developing a different affinity for its ligand (and in particular ICAM-1, for InterCellular Adhesion Molecule 1), which allows the T lymphocyte to adapt its adhesive properties according to the situation. In particular, it has been demonstrated in the literature that TCR (T Cell Receptor) stimulation can trigger the activation of LFA-1 molecules (high affinity for ICAM-1), which are then observed in the form of nanoclusters comprising a dozen of molecules.
The first objective of this thesis was to measure the effect of TCR stimulation on the activation and spatial organisation of LFA-1. Confocal microscopy and flow cytometry approaches demonstrated a progressive activation of LFA-1 with the degree of TCR stimulation. In a second step, I studied the spatial organisation of LFA-1 by STED microscopy (Stimulated Emission Depletion Microscopy). Cluster detection by machine-learning revealed that the inactive form of LFA-1 also exists as nanoclusters. These inactive nanoclusters are homogeneously distributed in the adhesion plane of the T cell, in contrast to the active nanoclusters, which are found in specific locations: the uropod in the case of the migrating cell, or organised as a belt in the p-SMAC, in the case of the cell forming an immunological synapse following the stimulation of its TCR. Further characterisation of these nanoclusters, and in particular their size and composition, suggests that LFA-1 nanoclusters are adhesive units, capable of switching from one conformational state to another, depending on the degree of TCR engagement.
The second objective of my work was to understand the link between LFA-1 activation, adhesion and killing. For this purpose, I used flow cytometry, which showed that LFA-1 activation and secretion of lytic granules occur at different thresholds of TCR stimulation. I also developed a live microscopy approach that measured interactions as well as killing between CD8+ T cells and target cells providing different levels of stimulation. This showed that target cells expressing fewer TCR stimulatory molecules have a lower probability of being hit and killed by the CD8+ T cell. I also measured the influence of ICAM-1 on the processes of LFA-1 activation, subsequent adhesion, and killing. Indeed, data from the literature suggest that the presence of a ligand (here, ICAM-1) is necessary for LFA-1 activation. By re-using previous methods, I then observed that a decrease in accessibility to ICAM-1 molecules leads to a decrease in LFA-1 activation, which had a significant impact on lymphocyte adhesion as well as on its cytotoxic capacities.
Another aspect of my thesis was the development of a numerical and physical model, based on my experimental data. I modelled an immunological synapse, composed of the membranes of a target cell and a CD8+ T cell. The molecules in each membrane are able to interact, resulting in the emergence of patterns that can be observed in real immunological synapses.
In conclusion, this thesis work provides new insights into the close link between TCR stimulation and LFA-1 activation and its spatial organisation. LFA-1 appears to be a key molecule in the cytotoxic response, capable of modulating adhesion via its organization in nanoclusters, capable of switching from one conformational state to another. |