La préparation d’un échantillon d’ADN est une étape obligatoire de sa chaîne analytique. Réalisée concomitamment ou postérieurement à l’extraction d’ADN de l’organisme ciblé, la préparation inclut une étape de concentration voire de fractionnement en fonction de la taille des chaînes d’ADN. Les outils de préparation d’ADN sont le plus souvent fondés sur des colonnes de silice et quelques fois aussi l’électrophorèse sur gel. Ils sont laborieux en temps de main d’œuvre et leur rendement pas toujours au rendez-vous. Ces considérations sont particulièrement critiques pour la préparation de l’ADN circulant dans le sang, un biomarqueur prometteur, car il est très dilué, présentant des tailles variées de petits fragments de 100 pb (paires de bases) à plus de 2 kpb et dissous dans des fluides biologiques complexes avec des sels et des protéines.
Nous avons investigué le potentiel de la technologie µLAS pour la préparation d’ADN. Fondée sur la migration d’ADN dans un fluide viscoélastique et sous écoulement électro-hydrodynamique, elle permet d’analyser des solutions complexes avec des sensibilités au fg/µL. Cela dit, son débit actuel de quelque µL/min n’est pas adapté à préparation d’ADN. Aussi, nous avons parallélisé µLAS avec une membrane isopore intégrée à un système macrométrique imprimé en 3D pour atteindre des performances adaptées à la purification à travers des centaines de milliers de canaux microfluidiques en simultané. Nous avons réalisé le traitement haut débit (300 µL/min) de quelques mL d’ADN dans une gamme de taille comprise entre 200 paires de bases (pb) et 50 kpb, avec une concentration jusqu’à 10 fois et la purification des sels. Le procédé, d’une durée inférieure à dix minutes, présente également l’avantage de fonctionner à faibles amplitudes d’actionnement : une pression inférieure à 2 bar et une tension inférieure à 50 V rendant cette technologie facilement accessible. Pour terminer, nous discutons le potentiel de notre technologie pour la préparation d’échantillons pour leur caractérisation par séquençage. |
Prior to their analysis, crude DNA samples have to be processed through consecutive steps of purification, concentration, and size selection. These steps generally involve a number of time-consuming and low-yield tools, which are most often based on affinity columns and/or fractioning by gel electrophoresis. The fraction of DNA circulating in the blood is considered to be a promising biomarker, but its preparation is suffering from many of the aforementioned pitfalls because it is highly diluted, distributed in size (between 100 and 2000 base pairs (bp)), and solubilized in complex biofluids with salts and proteins.
The µLAS technology, which consists in conveying DNA molecules in electrohydrodynamic viscoelastic flows, has shown a great potential for DNA analysis with a sensitivity of 1 fg/µL. It is however limited in throughput because its analytical flow rate is 1 µL/min. In this PhD, we aimed at intensifying the potential of µLAS for purification by parallelizing this technology. For this, we used a format based on an isoporous membrane integrated within a 3D printed macrometric system, which offers a platform to operate hundred of thousand of channels simultaneously. We report a high throughput associated to a flow rate of 300 µL/min, and demonstrate efficient processing of a few mL of solution in the range of 200 bp to 50 kbp, with a concentration of up to 10 times, a size accordable DNA size selection threshold, and the purification of salts in a process of less than ten minutes. It also has the advantage to be functional at low amplitudes of actuation : a pressure lower than 2 bar and a voltage lower than 50 V making it easily accessible. Finally, we discuss its application potential for the preparation of sequencing samples. |