Dans ce travail, nous avons développé et utilisé un nouvel outil génétique basé sur l'utilisation d'un système chimérique toxine/antitoxine/chaperonne (TAC) bactérien, qui permet l'identification rapide de mutants chaperons évolués dirigés contre des peptides sujets à l'agrégation, y compris les peptides α-syn et le peptide aβ.
L'α-synucléine (α-syn) est une protéine de 14 kDa exprimée dans les neurones et associée à la maladie de Parkinson (MP), une maladie neurodégénérative qui touche plus de 10 millions de personnes dans le monde, avec des symptômes tels que la bradykinésie, la rigidité, les tremblements et l'anxiété. La protéine α-syn a une forte tendance à se déformer et à s'agréger in vivo et in vitro pour former des fibres amyloïdes, une structure très stable qui peut être observée post-mortem sous forme de points noirs dans le cerveau des patients atteints de la MP. Le peptide Aβ peut avoir une longueur différente (entre 38 et 42 résidus), mais il est également très agrégatif et capable de former des fibres amyloïdes. Les chaperons moléculaires, une classe de protéines qui aident d'autres protéines à se replier sans faire partie de leur structure finale, sont un moyen d'empêcher l'agrégation. Pour ce travail, nous avons sélectionné deux chaperons moléculaires appartenant à la famille des protéines à domaine J (JDP), à savoir les chaperons humains DNAJB1 et DNAJB6b. Il a été prouvé que DNAJB1 interagit avec l'α-syn in-vivo et in-vitro, et est capable de briser les fibres préformées de l'α-syn en collaboration avec HSP70 (Gao, 2015 ; Wentink 2020). DNAJB6b est un puissant suppresseur de l'agrégation aβ (42), à des rapports substoichométriques remarquablement bas (Manson, 2014).
Dans la TAC, l'antitoxine est déstabilisée par une extension C-term que nous avons nommée ChAD (Bordes, 2016). Cette région est propice à l'agrégation et constitue également le site de liaison de la chaperonne dédiée (Bordes, 2016). Pour ce travail, nous avons remplacé avec succès cette partie par des régions sujettes à l'agrégation de nos protéines d'intérêt. Nous avons montré que les antitoxines chimériques étaient toujours instables, et induisaient une toxicité dans notre essai in-vivo. De manière remarquable, le chaperon dédié n'était pas capable de sauver fonctionnellement les chimères d'antitoxines que nous avons construites. Ni le DNAJB1 ni le DNAJB6b de type sauvage n'ont permis le sauvetage fonctionnel des antitoxines chimériques.
La co-expression du système chimérique TA et d'une bibliothèque de variantes aléatoires de mutants de chaperons dans une souche de type sauvage d'E.coli a permis d'identifier des substitutions dans les deux chaperons. Le chaperon DNAJB6b a évolué vers le peptide aβ (Taβ), et le chaperon DNAJB1 vers la protéine α-syn (TA α-syn). Pour DNAJB6b, nous avons identifié deux mutations qui permettent le sauvetage fonctionnel de la Taβ, tandis que quatre mutations dans le chaperon DNAJB1 pourraient sauver fonctionnellement la TA α-syn. Les mutants DNAJB1* ont été reconstruits comme des mutations ponctuelles et purifiés pour une évaluation in vitro plus poussée. Nous avons testé leur fonction générique de chaperon par l'étude in vitro de substrats modèles de repliement (luciférase dénaturée par la chaleur) et l'activité ATPase de HSP70. Nous avons également testé la capacité des mutants DNAJB1* à désagréger efficacement les fibres α-syn préformées en collaboration avec HSP70, et à empêcher l'agrégation en graine d'α-syn monomérique. Dans l'ensemble, les mutants DNAJB1* empêchent mieux l'agrégation de l'α-syn, sans pour autant perdre leurs fonctions génériques. Cependant, tous les mutants DNAJB1* ont perdu une partie de leur capacité à désagréger les fibres d'α-syn préformées en collaboration avec HSP70. Tous ces résultats nous permettront de proposer des pistes thérapeutiques pour contrôler et/ou lutter contre la maladie de Parkinson. |
In this work, we have developed and used a new genetic tool based on the use of a bacterial toxin/antitoxin/chaperone (TAC) chimeric system, which allows the rapid identification of evolved chaperone mutants directed against aggregation-prone peptides, including α-syn peptides and aβ peptide.
α-synuclein (α-syn) is a 14-kDa protein that is expressed in neurons and has been associated with Parkinson’s Disease (PD), a neurodegenerative disease that affects more than 10 million people worldwide, with symptoms including bradykinesia, rigidity, tremor, and anxiety. The α-syn protein has a strong tendency to misfold and aggregate in vivo and in vitro forming amyloid fibers, a very stable structure that can be observed postmortem as black dots in the brains of PD patients. Aβ peptide can differ in length (between 38 and 42 residues), but is also highly aggregative and capable of forming amyloid fibers. One way to prevent the aggregation are through molecular chaperones, a class of protein that helps other proteins to fold without being part of their final structure. For this work we have selected two molecular chaperones belonging to the J-Domain Protein (JDP) family, namely the humans chaperones DNAJB1 and DNAJB6b. DNAJB1 was proven to interact with α-syn in-vivo and in-vitro, and is capable of breaking the α-syn preformed fibers in collaboration with HSP70 (Gao, 2015; Wentink 2020). DNAJB6b is a potent suppressor of aβ (42) aggregation, at remarkably low substoichometric ratios (Manson, 2014).
In TAC, the antitoxin is destabilized through a C-term extension that we named ChAD (Bordes, 2016). This region is aggregative prone, and also the binding site of the dedicated chaperone (Bordes, 2016). For this work, we have successfully replaced this part with aggregation-prone regions of our proteins of interest. We show that the chimeric antitoxins were still unstable, and inducing toxicity in our in-vivo assay. Remarkably, the dedicated chaperone was not capable of functionally rescuing the antitoxin chimeras we constructed. Neither DNAJB1 nor DNAJB6b wild-type allowed the functional rescue of the chimeric antitoxins.
Co-expressing the chimeric TA system and a random variant library of chaperone mutant in a wild-type strain of E.coli allowed the identification of substitutions in both chaperones. The DNAJB6b chaperone was evolved towards the aβ peptide (Taβ), and the DNAJB1 chaperone towards the α-syn protein (TA α-syn). For DNAJB6b, we have identified two mutations that allows the functional rescue of the Taβ, while four mutations in the DNAJB1 chaperone could functionally rescue the TA α-syn. The DNAJB1* mutants were reconstructed as single point mutations and purified for further in-vitro evaluation. We tested their generic chaperone function via the in vitro study of folding model substrates (heat denatured luciferase) and the ATPase activity of HSP70. We also tested the capacity of DNAJB1* mutants to efficiently disaggregate pre-formed α-syn fibers in collaboration with HSP70, and prevent the seeded aggregation of monomeric α-syn. Overall, the DNAJB1* mutants are better at preventing α-syn aggregation, at no cost of their generic functions. However, all DNAJB1* mutants all lost some ability to disaggregate the preformed α-syn fibers in collaboration with HSP70. All these results will allow us to propose therapeutic avenues to control and/or fight against Parkinson's disease. |